[發明專利]應用噬菌體裂解酶降解豬鏈球菌生物被膜的方法

有效

• 申請號: 201110068767.4
• 申請日: 2011-03-22
• 公開（公告）號: CN102198265A
• 公開（公告）日: 2011-09-28
• 發明（設計）人: 孫建和;孟祥朋;嚴亞賢;陸承平;張靜
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: A61K38/51
• 分類號: A61K38/51;A61P31/04
• 代理公司: 上海交達專利事務所 31201
• 代理人: 王錫麟;王桂忠

技術領域

本發明涉及的是一種生物技術領域的方法，具體是一種應用噬菌體裂解酶降解豬鏈球菌生物被膜的方法。

背景技術

豬鏈球菌病是一種人獸共患傳染病，能導致仔豬患腦膜炎、敗血癥、關節炎、心內膜炎、肺炎和人的腦膜炎。豬鏈球菌2型流行最廣，對豬的致病力也最強，給養豬業造成巨大的經濟損失，在公共衛生方面，對相關從業人員的生命安全構成嚴重威脅。而更為嚴重的是，當豬鏈球菌形成生物被膜時，生物被膜會為細菌提供一種保護性生活方式，可能大大提高其致病性。細菌生物被膜是指由細菌自身產生的胞外多糖基質、脂蛋白、纖維蛋白等所包裹的細菌細胞的結構群落，其形如膜狀，能夠不可逆地附著于病灶的表面或醫用器械內。細菌生物被膜的形成增強了細菌對各種因素的抵抗力，是引起許多持續性和慢性細菌感染的根源。生物被膜內的細菌幾乎對所有的抗菌藥物都表現出極強的耐受性，因此增加了治療的難度。絕大多數細菌生長在各種物體表面的生物被膜中，某些豬鏈球菌也可以形成生物被膜。細菌生物被膜的存在對生物醫學、食品加工等方面極為不利。在對豬鏈球菌生物被膜進行清除時，抗生素的清除效果并不明顯，一方面是由于生物被膜對抗生素的進入產生了物理性阻礙，另一方面是由于抗菌藥物的廣泛應用使細菌耐藥性增強。而裂解酶是由噬菌體基因組編碼，能夠水解細菌細胞壁的酶。噬菌體裂解酶像噬菌體一樣僅攻擊細菌，而不影響動物細胞，并具有較高的特異性，因此該酶不影響無害或有益的動物寄生菌。一般認為，裂解酶作用于細菌的速度極快，以致于細菌不會對該酶產生抗性。所以，裂解酶作為降解生物被膜的新型治療方法具有一定的優勢。本發明通過原核表達豬鏈球菌烈性噬菌體SMP的裂解基因，獲得了純化的有活性的裂解酶，在體外可對兩株臨床分離的豬鏈球菌所形成的生物被膜具有高效降解作用。

經過對現有技術的檢索發現，Daniel?Grenier，Louis?Grignon，Marcelo?Gottschalk在《The?Veterinary?Journal》2009年第179卷第292-295頁發表了“Characterisation?of?biofilm?formation?by?a?Streptococcus?suis?meningitis?isolate”，文中提及，分離自患腦膜炎病豬的豬鏈球菌II型菌株95-8242可以形成結構致密的生物被膜，生物被膜中的豬鏈球菌95-8242對青霉素G和氨芐青霉素的耐藥性遠強于游離菌，常規藥物難以降解豬鏈球菌生物被膜。王麗平、陸承平、唐家琪在《微生物學報》2004年第44卷第6期第794～799頁發表了“32種抗菌藥物對臨床分離豬源鏈球菌的體外抗菌活性”，文中提及，一些豬場分離的豬鏈球菌對32種抗菌藥物的耐藥性的研究結果顯示，臨床分離菌株以耐藥菌為主，且大都呈多重耐藥，尤其對磺胺類藥物、林可胺類、四環素類、大環內酯類、氨基甙類藥物的耐藥性最為嚴重，耐藥不僅普遍，且多為高度耐藥。綜上所述，尋找治療豬鏈球菌生物被膜的新方法顯得尤為重要。

發明內容

本發明針對現有技術存在的上述不足，提供一種應用噬菌體裂解酶降解豬鏈球菌生物被膜的方法，本發明在殺滅豬鏈球菌SS2-4和SS2-H的同時，也可以破壞生物被膜的結構以達到徹底清除生物被膜的作用。

本發明是通過以下技術方案實現的，本發明采用表達菌BL21-lys表達分子量為55kDa的裂解酶LySMP，經過Ni柱純化得到裂解酶，并在體外將該裂解酶降解利用細胞培養板培養得到的豬鏈球菌生物被膜。

所述的采用表達菌BL21-lys表達分子量為55kDa的裂解酶LySMP是指：選擇過夜培養的含質粒pET-28a-lys的大腸桿菌BL21的陽性克隆體10mL接種于1L含有50μg/mLKan的LB培養基中，37℃210轉/分振蕩培養2-3h至OD₆₀₀0.6～1.0，然后加入100mmol/L的IPTG?10mL至終濃度為1mmol/L，27℃170轉/分振蕩培養4h。

所述的純化是指：

首先經IPTG誘導的表達菌1L用10mM?PBS緩沖液洗滌一次后4700轉/分離心30分鐘，將沉淀溶于25mL預冷的裂解緩沖液，超聲破碎。超聲功率為400W，工作3s，間隔13s，40個循環。超聲后，細菌懸浮物10000g離心，取上清。以8個柱體積的裂解緩沖液洗Ni2+柱(購自GE)；

用預冷的50mM磷酸鈉緩沖液與5mM咪唑的混合液洗柱，然后用預冷的50mM磷酸鈉緩沖液和20mM咪唑的混合液洗柱，最后用50mM磷酸鈉緩沖液和250mM咪唑的混合溶液洗柱，收集的洗脫液，即為純化的裂解酶。

所述的離心均在4℃環境下進行操作。