[發(fā)明專利]應(yīng)用噬菌體裂解酶降解豬鏈球菌生物被膜的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110068767.4
• 申請日: 2011-03-22
• 公開（公告）號: CN102198265A
• 公開（公告）日: 2011-09-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孫建和;孟祥朋;嚴(yán)亞賢;陸承平;張靜
• 申請（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號: A61K38/51
• 分類號: A61K38/51;A61P31/04
• 代理公司: 上海交達(dá)專利事務(wù)所 31201
• 代理人: 王錫麟;王桂忠

1.一種應(yīng)用噬菌體裂解酶降解豬鏈球菌生物被膜的方法，其特征在于，采用表達(dá)菌BL21-lys表達(dá)分子量為55kDa的裂解酶LySMP，經(jīng)過Ni柱純化得到裂解酶，并在體外用該裂解酶降解利用細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)得到的豬鏈球菌生物被膜。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用噬菌體裂解酶降解豬鏈球菌生物被膜的方法，其特征是，所述的采用表達(dá)菌BL21-lys表達(dá)分子量為55kDa的裂解酶LySMP是指：選擇過夜培養(yǎng)的含質(zhì)粒pET-28a-lys的大腸桿菌BL21的陽性克隆體10mL接種于1L含有50μg/mLKan的LB培養(yǎng)基中，37℃210轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)2-3h至OD₆₀₀0.6～1.0，然后加入100mmol/L的IPTG?10mL至終濃度為1mmol/L，27℃170轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)4h。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用噬菌體裂解酶降解豬鏈球菌生物被膜的方法，其特征是，所述的純化是指：首先經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)菌1L用10mM?PBS緩沖液洗滌一次后4700轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，將沉淀溶于25mL預(yù)冷的裂解緩沖液，超聲破碎，超聲功率為400W，工作3s，間隔13s，40個循環(huán)，超聲后，細(xì)菌懸浮物10000g離心，取上清，以8個柱體積的裂解緩沖液洗Ni2+柱；然后用預(yù)冷的50mM磷酸鈉緩沖液與5mM咪唑的混合液洗柱，然后用預(yù)冷的50mM磷酸鈉緩沖液和20mM咪唑的混合液洗柱，最后用50mM磷酸鈉緩沖液和250mM咪唑的混合溶出液洗柱，收集的洗脫液，即為純化的裂解酶。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用噬菌體裂解酶降解豬鏈球菌生物被膜的方法，其特征是，所述的離心均在4℃環(huán)境下進(jìn)行操作。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用噬菌體裂解酶降解豬鏈球菌生物被膜的方法，其特征是，所述的裂解緩沖液為磷酸鈉緩沖液，其濃度為50mM且pH值為8.0。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用噬菌體裂解酶降解豬鏈球菌生物被膜的方法，其特征是，所述的生物被膜通過以下方式培養(yǎng)得到：

1)將培養(yǎng)好的豬鏈球菌20μL接種至每孔含有2mL?THB培養(yǎng)基的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，蓋上蓋子置37℃恒溫箱中培養(yǎng)3天；

2)3天后取出細(xì)胞培養(yǎng)板，用移液槍棄去游離培養(yǎng)基并用滅菌的PBS緩沖液洗滌兩次以去除游離菌，即得到成熟的生物被膜。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用噬菌體裂解酶降解豬鏈球菌生物被膜的方法，其特征是，所述的THB培養(yǎng)基中，每1L內(nèi)加入酵母浸出物3g、胰蛋白胨20g、牛肉浸膏5g、葡萄糖2g、NaCl10g、Na₂CO₃?2.5g、磷酸氫二鈉1.0008g以及20mL小牛血清，并將該培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)至7.5。