[發明專利]一種從土壤中提取總DNA的方法

無效

• 申請號: 201110067707.0
• 申請日: 2011-03-21
• 公開（公告）號: CN102181433A
• 公開（公告）日: 2011-09-14
• 發明（設計）人: 肖弘
• 申請（專利權）人: 肖弘
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236
• 代理人: 郭國中

技術領域

本發明涉及一種從土壤中提取總DNA的方法。

背景技術

土壤是微生物的良好生境，土壤中有多種類群的微生物，它們對自然界物質的轉化和循環起著極為重要的作用，對農業生產和環境保護有著不可忽視的影響。然而土壤中只有一小部分微生物可以分離培養出來。估計大約有99%的微生物不可培養，大大限制了人們對土壤微生物資源及其基因資源的研究與利用。近年來，以開發出多種土壤總DNA的提取方法，如：經SDS高鹽法、變性劑加SDS高鹽法、SDS-酚氯仿抽提法、或凍融溶菌酶SDS裂解法出提DNA后，采用葡聚糖-200凝膠G離心層析純化DNA、再進行PCR擴增。由于土壤樣品成分復雜，難以去除的酸類物質影響后續PCR擴增，且純化過程中會損失部分DNA，回收收率比較低，不能真實反映土壤微生態結構。

發明內容

本發明的目的在于提供一種從土壤中提取總DNA的方法，簡化提取方法，提高回收收率，真實反映土壤微生態結構。

本發明的從土壤中提取總DNA的方法，包括：

（a）、取土壤試樣，加1.5ml提取液，混勻，其中，所述土壤試樣與提取液的質量體積比為1:2.5~3.5，所述提取液含有：50~200nM?Tris，50~150nM?EDTA，100~200nM?NaCl，5~8wt%TEEPOL，pH為8.5~9.5；

（b）、置于-70~-85℃冷凍20~30min后取出于60~70℃水浴融化，如此反復凍融數次；

（c）、加入8~12mg/ml的蛋白酶K80~120ml震蕩25~35min，加入濃度為18~22%的SDS?180~230ml，置于60~70℃水浴1.5~2.5hr，離心收集上清；

（d）、所述上清加0.4~0.6倍體積的濃度為40~60w/v%的PEG混勻，靜置沉淀；

（e）、離心取沉淀，加入0.5~1ml?TE溶解，用等體積的氯仿/異戊醇抽提，離心，取上清；

（f）、用0.1~0.2倍體積的2~4mol/l的NaAc，以及0.5~0.8倍體積的冷異丙醇室溫沉淀后離心；

（g）、沉淀用60~80%(體積)乙醇洗滌，離心取沉淀，即得到總DNA。

根據本發明，所述凍融次數為3~5次。

根據本發明，所述步驟c中所述離心的條件為：室溫5500~6500r/min，離心8~15min。

根據本發明，所述步驟e、f、g中所述離心的條件均為：室溫10000~15000r/min，離心15~25min。

根據本發明，所述氯仿/異戊醇的體積比為20~30:1。

本發明的提取方法，無需回收純化DNA步驟，簡化提取步驟，提高回收收率，能有效提取總基因組DNA，真實反映土壤微生態結構。

具體實施方式

下面結合實施例來進一步說明本發明，但本發明方法的范圍并不局限于下述的實例。

實施例1?土壤總DNA提取

取土壤試樣0.5g，加1.25ml提取液，混勻，所述提取液含有：50nM?Tris，50nM?EDTA，100nM?NaCl，5wt%TEEPOL，pH為8.5。

置于-70~-85℃冷凍20~30min后取出于60~70℃水浴融化，如此反復凍融3次；接著加入8mg/ml的蛋白酶K80ml震蕩25~35min，加入濃度為18%的SDS?180ml，置于60~70℃水浴1.5~2.5hr，于室溫5500r/min，離心15min收集上清。

于上清加0.4~0.6倍體積的濃度為50w/v%的PEG8000混勻，靜置沉淀；室溫15000r/min，離心15min取沉淀，加入0.5ml?TE溶解，用等體積的氯仿/異戊醇抽提，所述氯仿/異戊醇的體積比為20:1，室溫15000r/min，離心15min取上清；用0.1倍體積的4mol/l的NaAc，以及0.8倍體積的冷異丙醇（于-20℃預冷）室溫沉淀后離心，室溫10000r/min，離心25min，沉淀用60%(體積)乙醇洗滌，室溫10000r/min，離心15min取沉淀，即得到總DNA。

實施例2?土壤總DNA提取

取土壤試樣0.5g，加1.?5ml提取液，混勻，所述提取液含有：150nM?Tris，120nM?EDTA，150nM?NaCl，6wt%TEEPOL，pH為9。