[發明專利]鮑肌肉萎縮癥病毒的快速診斷試劑盒及檢測方法

無效

• 申請號: 201110065749.0
• 申請日: 2011-03-18
• 公開（公告）號: CN102181574A
• 公開（公告）日: 2011-09-14
• 發明（設計）人: 姜敬哲;王江勇;郭志勛;莊軍;劉廣鋒
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院南海水產研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 廣州知友專利商標代理有限公司 44104
• 代理人: 宣國華

技術領域

本發明涉及水生經濟動物病害的診斷試劑盒及檢測方法，尤其是涉及鮑肌肉萎縮癥病毒的快速診斷試劑盒及檢測方法。

背景技術

鮑是中國傳統的名貴食材，其肉質鮮美、營養豐富，是世界各地廣泛的養殖的海產經濟貝類。2005年冬天，福建、廣東等地鮑養殖場普遍爆發大規模病害，癥狀主要表現為肌肉和外套膜萎縮，體色發黑，各階段鮑均可發病，對我國南方鮑養殖業造成毀滅性打擊。后經鑒定該病病原為肌肉萎縮癥病毒(Abalone?Shriveling?syndrome?associated?Virus，AbSV)。到目前為止，對于病毒病還沒有有效的治療方法，防止病毒的傳染和流行是能夠采取的主要措施，早期快速診斷該病毒是減少損失的有效途徑，因此，簡便快速、特異性好、靈敏度高的診斷試劑盒及其檢測方法對于疾病的預防意義重大。

多聚酶鏈式反應(polymerase?chain?reaction，簡稱PCR技術)，是目前流行的一種體外擴增特異DNA片段的技術，由于具有快速、敏感、特異性強等特點，所以這種方法建立后，廣泛應用于實踐中。

發明內容

本發明的第一個目的是提供一種鮑肌肉萎縮癥病毒的快速診斷試劑盒。

本發明的第二個目的是提供一種應用上述鮑肌肉萎縮癥病毒的快速診斷試劑盒進行鮑肌肉萎縮癥病毒的檢測方法。

本發明的第一個目是通過以下技術方案來實現的：鮑肌肉萎縮癥病毒的快速診斷試劑盒，其包括以下部件：

(1)DNA提取液；

(2)消化液；

(3)G1液：用于PCR一擴反應，包括含Mg2+的Buffer、dNTP、正向引物F1、反向引物R1和Taq酶；

F1為：5-ATGACAGATTTCACCGTAAGCAATGAAAATC-3，

R1為：5-CTAGCTGGCTTTGGTATAAGTAGTACCAAAAG-3；

(4)陽性對照H液：100ng/μL肌肉萎縮癥病毒感染的鮑基因組DNA。

若使用PCR一擴反應液檢測的結果為陰性，需要做進一步的檢測，因而本發明中所述試劑盒還包括以下部件：

(5)G2液：用于PCR二擴反應，包括含mg²⁺的Buffer、dNTP、正向引物F2、反向引物R2和Taq酶；

F2為：5-GCAACATTCCAGTTAGCC-3，

R2為：5-CCGTAGTAGCAGGAGCAA-3；

本發明所述PCR一擴反應液G1液中，含3mmol/L?Mg²⁺、100mmol/L?KCl、400μmol/LdNTPs、2μmol/L正向引物F1、2μmol/L反向引物R1、4U的Taq酶。

本發明所述PCR二擴反應液G2液中，含3mmol/L?Mg²⁺、100mmol/L?KCl、400μmol/LdNTPs、2μmol/L正向引物F2、2μmol/L反向引物R2、4U的Taq酶。

本發明所述的DNA提取液部件包括以下六種分別獨立盛裝在試劑容器中的溶液：

①A液：10mmol/L?Tris-Cl(pH8.0)，1mmol/L?EDTA和0.1％(m/V)SDS的混合溶液；

②B液：12mL的5mol/L醋酸鉀，2.3mL冰醋酸和5.7mL水的混合溶液；

③C液：異丙醇；

④D液：70％乙醇；

⑤E液：10mmol/L?Tris-cl(pH8.0)和1mmol/L?EDTA的混合溶液。

本發明所述的消化液包括以下兩種分別獨立盛裝在試劑容器中的溶液：

⑥F1液：20mg/mL蛋白酶K；

⑦F2液：4mg/mL?RNase?A。

本發明所述的肌肉萎縮癥病毒感染的鮑基因組DNA可采用常規方法進行制備，還可以采用以下方法制備：

1)取肌肉萎縮癥病毒感染的雜色鮑外套膜或肌肉組織樣本10-20mg加入400-800μLA液進行稀釋，于勻漿器中冰浴勻漿得勻漿液；

2)在步驟1)的勻漿液中加入2-4μL?F1液，50-60℃放置消化2-4個小時；

3)待步驟2)中的經F1液消化處理的勻漿液降至室溫，加入2-4μL?F2液，在37℃放置消化2-4個小時得到消化溶液；