[發(fā)明專利]鮑肌肉萎縮癥病毒的快速診斷試劑盒及檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110065749.0
• 申請日: 2011-03-18
• 公開（公告）號: CN102181574A
• 公開（公告）日: 2011-09-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姜敬哲;王江勇;郭志勛;莊軍;劉廣鋒
• 申請（專利權(quán)）人: 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 廣州知友專利商標(biāo)代理有限公司 44104
• 代理人: 宣國華

1.鮑肌肉萎縮癥病毒的快速診斷試劑盒，其特征在于，其包括以下部件：

(1)DNA提取液；

(2)消化液；

(3)G1液：用于PCR一擴(kuò)反應(yīng)，包括含Mg2+的Buffer、dNTP、正向引物F1、反向引物R1和Taq酶；

F1為：5-ATGACAGATTTCACCGTAAGCAATGAAAATC-3，

R1為：5-CTAGCTGGCTTTGGTATAAGTAGTACCAAAAG-3；

(4)陽性對照H液：100ng/μL肌肉萎縮癥病毒感染的鮑基因組DNA。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鮑肌肉萎縮癥病毒的快速診斷試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括以下部件：

(5)G2液：用于PCR二擴(kuò)反應(yīng)，包括含mg²⁺的Buffer、dNTP、正向引物F2、反向引物R2和Taq酶；

F2為：5-GCAACATTCCAGTTAGCC-3，

R2為：5-CCGTAGTAGCAGGAGCAA-3。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鮑肌肉萎縮癥病毒的快速診斷試劑盒，其特征在于：所述PCR一擴(kuò)反應(yīng)液G1液中，含3mmol/L?Mg²⁺、100mmol/L?KCl、400μmol/LdNTPs、2μmol/L正向引物F1、2μmol/L反向引物R1、4U的Taq酶；

所述PCR二擴(kuò)反應(yīng)液G2液中，含3mmol/L?Mg²⁺、100mmol/L?KCl、400μmol/LdNTPs、2μmol/L正向引物F2、2μmol/L反向引物R2、4U的Taq酶。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的鮑肌肉萎縮癥病毒的快速診斷試劑盒，其特征在于，所述的DNA提取液部件包括以下六種分別獨(dú)立盛裝在試劑容器中的溶液：

①A液：10mmol/L?Tris-Cl(pH8.0)，1mmol/L?EDTA和0.1％(m/V)SDS的混合溶液；

②B液：12mL的5mol/L醋酸鉀，2.3mL冰醋酸和5.7mL水的混合溶液；

③C液：異丙醇；

④D液：70％乙醇；

⑤E液：10mmol/L?Tris-cl(pH8.0)和1mmol/L?EDTA的混合溶液；

所述的消化液包括以下兩種分別獨(dú)立盛裝在試劑容器中的溶液：

⑥F1液：20mg/mL蛋白酶K；

⑦F2液：4mg/mL?RNase?A。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的鮑肌肉萎縮癥病毒的快速診斷試劑盒，其特征在于，所述的肌肉萎縮癥病毒感染的鮑基因組DNA下方法制備：

1)取肌肉萎縮癥病毒感染的雜色鮑外套膜或肌肉組織樣本10-20mg加入400-800μL?A液進(jìn)行稀釋，于勻漿器中冰浴勻漿得勻漿液；

2)在步驟1)的勻漿液中加入2-4μL?F1液，50-60℃放置消化2-4個(gè)小時(shí)；

3)待步驟2)中的經(jīng)F1液消化處理的勻漿液降至室溫，加入2-4μL?F2液，在37℃放置消化2-4個(gè)小時(shí)得到消化溶液；

4)在步驟3)的消化溶液中加入100-300μL?B液，劇烈震蕩10-30s；然后在4℃下離心1-5min，取上清液，加入等體積C液混勻，再在4℃下離心1-5min，棄上清液，所得的沉淀物用400～800μL預(yù)冷的D液洗滌后，4℃離心1-5min；

5)所述步驟4)中經(jīng)洗滌后的沉淀物經(jīng)干燥后，加50-150μL?E液溶解，得到肌肉萎縮癥病毒感染的鮑基因組DNA。