[發明專利]檢測維生素C二步發酵中細胞內代謝物變化的方法

無效

• 申請號: 201110065064.6
• 申請日: 2011-03-17
• 公開（公告）號: CN102174634A
• 公開（公告）日: 2011-09-07
• 發明（設計）人: 元英進;周劍;崔永濤;孫君偉
• 申請（專利權）人: 天津大學;河北維爾康制藥有限公司
• 主分類號: C12Q1/00
• 分類號: C12Q1/00;G01N30/02;C12R1/11;C12R1/01
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 陸藝

技術領域

本發明屬于工業微生物領域，涉及一種檢測維生素C二步發酵中細胞內代謝物的變化的方法。

背景技術

細胞內小分子代謝物是細胞代謝的重要組成部分，中糖類物質是重要的能源物質，脂肪酸則主要用于細胞的能量儲備和構成細胞膜，氨基酸是構成蛋白質的基礎結構，核苷酸類物質除了構成DNA和RNA之外也參與細胞的信號轉導和能量轉化過程。隨著質譜技術的發展，細胞內小分子代謝物，包括有機酸，氨基酸，醇類化合物，胺類化合物，芳香族化合物及糖類等可以被高通量的檢測。由于這種高通量的特點，可以從整體水平上檢測細胞在發酵過程中產生的包含上述各類物質的整體代謝水平上的變化。

維生素C的二步發酵是由巨大芽孢桿菌和酮古龍酸桿菌共同作用完成發酵的，其內在調控機理尚不明確，這就使優化工業生產過程變得困難，也增加了生產中控制發酵過程的難度，如果通過高通量的代謝物組學的手段了解混菌發酵過程中的物質遷移規律，將有利于揭示兩種菌在發酵過程中的相互關系，從而有利于彌補現有過程中的上述不足。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術中的不足，提供一種檢測維生素C二步發酵中細胞內代謝物變化的方法。

本發明的技術方案概述如下：

一種檢測維生素C二步發酵中細胞內代謝物變化的方法，包括下述步驟：

(1)對維生素C二步發酵中所用的巨大芽孢桿菌(Bacillus?megaterium)和氧化葡糖桿菌(Gluconobacter?oxydans)細胞內的小分子代謝物進行測定：

①細胞收集及淬滅：

將所述巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌進行發酵，在發酵過程中選3-5個時間點，所述時間點位于所述發酵過程的前期、中期和后期，在所述時間點快速取出發酵液樣品，離心，收集下層的細胞，并用磷酸鹽緩沖液清洗，立即用液氮淬滅，終止代謝反應；用液氮研磨細胞以除去樣品中大量的水分，并破碎細胞，獲得3-5份破碎細胞；

②提取細胞內小分子代謝物：

取步驟①獲得的3-5份破碎細胞20-100mg分別置于離心管中，加入0.5-2.0ml-40℃保存的體積濃度為50％的甲醇水溶液為提取液，并加入10μl-20μl的0.07-0.14mg/ml氘標記的丁二酸的水溶液為內標物，混勻；置于液氮中反復凍融2-4次，每次凍0.5-3.0min；離心收集上清得到A液；再次加入體積濃度為50％的甲醇水溶液為提取液0.5-2.0ml，混合均勻，離心收集上清，得到B液，將所述A液和B液混勻，并冷凍干燥；

③衍生化：

向步驟②獲得的凍干的樣品中加入40-60μl的20mg/ml甲氧基胺鹽酸鹽吡啶溶液，30-40℃水浴，進行肟化反應60-100min；再加入50-100μl的N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺，35-40℃水浴，進行硅烷化反應30-80min；

④用氣相色譜-飛行時間質譜聯用儀測定步驟③獲得樣品成分及相對含量：

將1μl步驟③獲得樣品進到氣相色譜中，色譜柱為DB-5MS，所述色譜柱的規格為30m×0.25mm?i.d.，進樣口溫度250℃-280℃，載氣為高純氦氣，柱溫箱升溫程序為：初始50℃-80℃保持2min-5min，以4℃/min-8℃/min的速度升到260℃-300℃，保持3min-8min，使用EI電離源，源溫230℃-260℃，檢測器電壓2300V-2700V，電離電壓60eV-80eV，電流30μA-50μA；質譜檢測范圍50-800m/z；小分子代謝物的鑒定使用NIST數據庫，質譜數據的處理和小分子代謝物相對含量的測定使用Masslynx?4.1軟件；并通過對色譜峰面積積分處理，并與內標物的峰面積對照，得到維生素C二步發酵過程中細胞內各個小分子代謝物的相對含量；

(2)主成分分析：

①將步驟(1)獲得的各個小分子代謝物的相對含量的數據進行標準化；

②用Markerlynx軟件對步驟(2)中步驟①獲得的標準化后的數據進行主成分分析，得到用于表達樣本相似性和差異性的得分圖和載荷圖；在得分圖中，樣品點相互之間距離越近，說明樣本的相似度越大，距離越遠，說明樣本差異越大，用來比較生產過程中各個階段內細胞內小分子代謝物的相似和差異；在載荷圖中，每個點表示各個小分子代謝物，距離中心點距離越遠的小分子代謝物，其在維生素C發酵生產過程中的差異就越大，可作為重要的候選代謝物進行分析；

(3)過程分析