[發明專利]檢測維生素C二步發酵中細胞內代謝物變化的方法

無效

• 申請號: 201110065064.6
• 申請日: 2011-03-17
• 公開（公告）號: CN102174634A
• 公開（公告）日: 2011-09-07
• 發明（設計）人: 元英進;周劍;崔永濤;孫君偉
• 申請（專利權）人: 天津大學;河北維爾康制藥有限公司
• 主分類號: C12Q1/00
• 分類號: C12Q1/00;G01N30/02;C12R1/11;C12R1/01
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 陸藝

1.一種檢測維生素C二步發酵中細胞內代謝物變化的方法，包括下述步驟：

(1)對維生素C二步發酵中所用的巨大芽孢桿菌(Bacillus?megaterium)和氧化葡糖桿菌(Gluconobacter?oxydans)細胞內的小分子代謝物進行測定：

①細胞收集及淬滅：

將所述巨大芽孢桿菌和氧化葡糖桿菌進行發酵，在發酵過程中選3-5個時間點，所述時間點位于所述發酵過程的前期、中期和后期，在所述時間點快速取出發酵液樣品，離心，收集下層的細胞，并用磷酸鹽緩沖液清洗，立即用液氮淬滅，終止代謝反應；用液氮研磨細胞以除去樣品中大量的水分，并破碎細胞，獲得3-5份破碎細胞；

②提取細胞內小分子代謝物：

取步驟①獲得的3-5份破碎細胞20-100mg分別置于離心管中，加入0.5-2.0ml-40℃保存的體積濃度為50％的甲醇水溶液為提取液，并加入10μl-20μl的0.07-0.14mg/ml氘標記的丁二酸的水溶液為內標物，混勻；置于液氮中反復凍融2-4次，每次凍0.5-3.0min；離心收集上清得到A液；再次加入體積濃度為50％的甲醇水溶液為提取液0.5-2.0ml，混合均勻，離心收集上清，得到B液，將所述A液和B液混勻，并冷凍干燥；

③衍生化：

向步驟②獲得的凍干的樣品中加入40-60μl的20mg/ml甲氧基胺鹽酸鹽吡啶溶液，30-40℃水浴，進行肟化反應60-100min；再加入50-100μl的N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺，35-40℃水浴，進行硅烷化反應30-80min；

④用氣相色譜-飛行時間質譜聯用儀測定步驟③獲得樣品成分及相對含量：

將1μl步驟③獲得樣品進到氣相色譜中，色譜柱為DB-5MS，所述色譜柱的規格為30m×0.25mm?i.d.，進樣口溫度250℃-280℃，載氣為高純氦氣，柱溫箱升溫程序為：初始50℃-80℃保持2min-5min，以4℃/min-8℃/min的速度升到260℃-300℃，保持3min-8min，使用EI電離源，源溫230℃-260℃，檢測器電壓2300V-2700V，電離電壓60eV-80eV，電流30μA-50μA；質譜檢測范圍50-800m/z；小分子代謝物的鑒定使用NIST數據庫，質譜數據的處理和小分子代謝物相對含量的測定使用Masslynx?4.1軟件；并通過對色譜峰面積積分處理，并與內標物的峰面積對照，得到維生素C二步發酵過程中細胞內各個小分子代謝物的相對含量；

(2)主成分分析：

①將步驟(1)獲得的各個小分子代謝物的相對含量的數據進行標準化；

②用Markerlynx軟件對步驟(2)中步驟①獲得的標準化后的數據進行主成分分析，得到用于表達樣本相似性和差異性的得分圖和載荷圖；在得分圖中，樣品點相互之間距離越近，說明樣本的相似度越大，距離越遠，說明樣本差異越大，用來比較生產過程中各個階段內細胞內小分子代謝物的相似和差異；在載荷圖中，每個點表示各個小分子代謝物，距離中心點距離越遠的小分子代謝物，其在維生素C發酵生產過程中的差異就越大，可作為重要的候選代謝物進行分析；

(3)過程分析

將步驟(2)得到的候選代謝物中對細胞生理狀態具有重要意義物質的含量按照時間序列制成圖表，觀察并分析這些物質變化的規律，進而發現其在維生素二步發酵過程中的作用。