[發明專利]一種刪除轉基因楊樹選擇標記基因的方法

有效

• 申請號: 201110063438.0
• 申請日: 2011-03-16
• 公開（公告）號: CN102181476A
• 公開（公告）日: 2011-09-14
• 發明（設計）人: 諸葛強;陶玉峰;周潔;王立科;潘惠新;黃敏仁;陳英;王光萍
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/09
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 柏尚春

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體地說涉及一種刪除轉基因楊樹選擇標記基因的方法。

背景技術

楊樹是世界上重要的造林樹種之一，在我國人工林中楊樹也有較大比重。在林木植物中楊樹是較早開展轉基因研究的樹種之一，據報道通過基因工程技術已成功轉入了抗病蟲、耐鹽堿、抗大氣污染、降低木質素含量、增加生長量等基因，為培育具有優良性狀的轉基因楊樹新品種提供了基礎。但由于轉基因植物的安全性等問題限制了轉基因楊樹的環境釋放和推廣應用。

近年來，轉基因植物的安全性受到廣泛關注，而轉基因技術中標記基因的安全性問題已成為當今基因工程研究的熱點。篩選標記基因作為標記基因的一種，是指在遺傳轉化中能夠使轉化細胞（或個體）從眾多的非轉化細胞中篩選出來的標記基因；目前常用的篩選標記基因主要有兩大類，即抗生素抗性酶基因和除草劑抗性酶基因；這兩類標記基因在完成篩選后并不參與植物的性狀改良，它在植物中的存在便是多余的，且可能對環境或非靶標生物存在潛在風險，如轉基因植物的抗生素抗性標記基因可能會轉移進入人或動物的病原菌中，從而引起這些病原菌對抗生素的抗性，使抗生素失去效力；標記基因也可能會轉移到雜草產生所謂“超級雜草”，破壞生態安全。如何消除選擇標記，培育無選擇標記的轉基因植物已成為基因工程研究的熱點。

王永剛（2007）在“無選擇標記遺傳轉化體系研究”（南京林業大學碩士學位論文）一文中雖利用Cre/lox系統進行楊樹無選擇標記遺傳轉化體系研究，但未獲得刪除選擇標記基因的轉基因楊樹；府健（2007）在《南林895楊無選擇標記遺傳轉化的研究》（南京林業大學碩士學位論文）也利用該系統進行無選擇標記轉基因楊樹的研究，但在21株轉基因楊樹中僅檢測出一株刪除了選擇標記基因，僅約為5%，刪除效率較低。

發明內容

發明目的：針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種刪除轉基因楊樹選擇標記基因的方法，利用Cre/lox系統具有的重組刪除功能，建立無選擇標記基因的楊樹轉基因體系，為培育具生物安全的轉基因楊樹新品種提供一個新途徑，為安全、高效的林木轉基因育種提供基礎。

發明內容：為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案為：一種刪除轉基因楊樹選擇標記基因的方法，包括以下步驟：

（1）采用感受態熱激法將pX6-GFP質粒轉入農桿菌EHA105，菌液涂抹在含有抗生素的YEB平板上，28℃培養24~36h，得轉化后的單菌落，備用；

（2）將經分析鑒定的轉基因楊樹試管苗置于培養基M上，以根部萌蘗芽方式繼代繁殖1個月，備用；培養基M的配方為在基本培養基MS中添加蔗糖25~30g/L和瓊脂6~7g/L，pH5.6~5.8。

（3）在步驟（2）培養的試管苗上選取幼嫩、平展的葉，剪去葉邊緣，得葉盤為外植體，接種于葉盤分化培養基T上，控溫25±2℃，光照3000~4000lux，光照時間16~18h/d，培養2~3d；

（4）在農桿菌液體培養基中擴大培養步驟（1）的單菌落，得指數生長期的菌體，在基本培養基MS液體培養基懸浮菌體，得OD₆₀₀值為0.3~0.4的侵染菌液；

（5）將步驟（3）的培養后的外植體浸入步驟（4）的侵染菌液，振蕩，浸泡10~15min，除去多余菌液，轉至含有50~100μmol/L乙酰丁香酮的葉盤分化培養基T上暗培養2~3d，期間多次洗除菌液；

（6）先將步驟（5）暗培養后的葉盤轉移到葉盤分化篩選培養基W上培養，直至分化出不定芽；再將不定芽連同外植體一同移入不定芽伸長篩選培養基Y繼代培養；待不定芽伸長至1.5~2cm長，將每個不定芽分離獨立移入生根篩選培養基G，直至形成完整植株，對轉基因植株進行分析鑒定；