[發明專利]一種刪除轉基因楊樹選擇標記基因的方法

有效

• 申請號: 201110063438.0
• 申請日: 2011-03-16
• 公開（公告）號: CN102181476A
• 公開（公告）日: 2011-09-14
• 發明（設計）人: 諸葛強;陶玉峰;周潔;王立科;潘惠新;黃敏仁;陳英;王光萍
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/09
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 柏尚春

1.一種刪除轉基因楊樹選擇標記基因的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

（1）采用感受態熱激法將pX6-GFP質粒轉入農桿菌EHA105，菌液涂抹在含有抗生素的YEB平板上，28℃培養24~36h，得轉化后的單菌落，備用；

（2）將轉基因楊樹試管苗置于培養基M上以根部萌蘗芽方式繼代繁殖1個月，備用；其中，培養基M的配方為在基本培養基MS中添加：蔗糖25~30g/L和瓊脂6~7g/L，pH5.6~5.8；

（3）在步驟（2）培養的試管苗上選取幼嫩、平展的葉，剪去葉邊緣，得葉盤為外植體，接種于葉盤分化培養基T上，控溫25±2℃，光照3000~4000lux，光照時間16~18h/d，培養2~3d；

（4）在農桿菌液體培養基中擴大培養步驟（1）的單菌落，得指數生長期的菌體，在基本培養基MS液體培養基懸浮菌體，得OD₆₀₀值為0.3~0.4的侵染菌液；

（5）將步驟（3）的培養后的外植體浸入步驟（4）的侵染菌液，振蕩，浸泡10~15min，除去多余菌液，轉至含有50~100μmol/L乙酰丁香酮的葉盤分化培養基T上暗培養2~3d，期間多次洗除菌液；

（6）先將步驟（5）暗培養后的葉盤轉移到葉盤分化篩選培養基W上培養，直至分化出不定芽；再將不定芽連同外植體一同移入不定芽伸長篩選培養基Y繼代培養；待不定芽伸長至1.5~2cm長，將每個不定芽分離獨立移入生根篩選培養基G，直至形成完整植體；

（7）剪取步驟（6）中完整植株的莖段，依次在刪除選擇標記分化培養基W’、刪除選擇標記不定芽伸長培養基Y’、刪除選擇標記生根培養基G’中培養誘導愈傷組織至植株再生；利用培養基中添加的β-雌二醇，通過誘導步驟（8）獲得的轉基因植株莖段形成愈傷至植株再生過程刪除選擇標記基因；

（8）對步驟（7）的轉基因植株進行PCR分子檢測和卡那霉素敏感性試驗檢測。

2.根據權利要求1所述的根據權利要求1所述的刪除轉基因楊樹選擇標記基因的方法，其特征在于：步驟（3）中，所述葉盤分化培養基T配方為在基本培養基MS中附加：蔗糖25~30g/L，瓊脂6~7g/L，TDZ0.002~0.003mg/L，BA0.5~0.6mg/L，瓊脂6~7g/L。

3.根據權利要求1所述的刪除轉基因楊樹選擇標記基因的方法，其特征在于：步驟（6）中，所述的葉盤分化篩選培養基W配方為：MS，TDZ0.002~0.003mg/L，BA0.5~0.6mg/L，卡那霉素20mg/L，蔗糖30g/L，瓊脂6~7g/L，pH5.6~5.8。

4.根據權利要求1所述的刪除轉基因楊樹選擇標記基因的方法，其特征在于：步驟（6）中，所述的不定芽伸長篩選培養基Y配方為：MS，TDZ0.001~0.002mg/L，BA0.2~0.3mg/L，卡那霉素20mg/L，蔗糖30g/L，瓊脂6~7g/L，pH5.6~5.8。

5.根據權利要求1所述的刪除轉基因楊樹選擇標記基因的方法，其特征在于：步驟（6）中，所述的生根篩選培養基G配方為：MS，IAA0.1~0.2mg/L，卡那霉素10mg/L，蔗糖20g/L，瓊脂6~7g/L，pH5.6~5.8。

6.根據權利要求1所述的刪除轉基因楊樹選擇標記基因的方法，其特征在于：步驟（7）中，所述刪除選擇標記分化培養基W’配方為：在基本培養基MS中添加：TDZ?0.002~0.003mg/L、BA?0.5~0.6mg/L、5μM?β-雌二醇、蔗糖?30g/L和瓊脂6~7g/L，pH5.6~5.8。

7.根據權利要求1所述的刪除轉基因楊樹選擇標記基因的方法，其特征在于：步驟（7）中，所述刪除選擇標記不定芽伸長培養基Y’配方為：在基本培養基MS中添加：TDZ?0.001~0.002mg/L、BA?0.2~0.3mg/L、5μM?β-雌二醇、蔗糖30g/L和瓊脂6~7g/L，pH5.6~5.8。

8.根據權利要求1所述的刪除轉基因楊樹選擇標記基因的方法，其特征在于：步驟（7）中，所述刪除選擇標記生根培養基G’的配方為：在1/2基本培養基MS中添加：IAA?0.1~0.2mg/L、5μM?β-雌二醇、蔗糖20g/L和瓊脂6~7g/L，pH5.6-5.8。