[發明專利]黃曲霉毒素M1免疫層析試紙條及其制備方法

無效

• 申請號: 201110062947.1
• 申請日: 2011-03-16
• 公開（公告）號: CN102109518A
• 公開（公告）日: 2011-06-29
• 發明（設計）人: 李培武;張道宏;張奇;張文;管笛;丁小霞;姜俊
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院油料作物研究所
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;G01N33/532
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 胡建平

技術領域

本發明屬生物檢測領域，具體涉及一種黃曲霉毒素M1免疫層析試紙條及其制備方法。

背景技術

黃曲霉毒素主要是由黃曲霉和寄生曲霉分泌產生的次生代謝產物，是一種能引起人畜各種損害的天然有毒化合物。黃曲霉毒素(AFT)目前已發現20余種，其中黃曲霉毒素B1為毒性及致癌性最強的物質。黃曲霉毒素M1是黃曲霉毒素B1的羥基化代謝產物，也是一種強致癌物質。當哺乳動物攝入AFB1污染的飼料后，在體內經羥基化會將AFM1分泌于乳汁當中。奶牛經攝入黃曲霉毒素B1污染的飼料后產出的牛奶中便含有黃曲霉毒素M1。由于黃曲霉毒素M1相當穩定，巴氏滅菌法也無法將其殺滅，所以檢測黃曲霉毒素M1不僅要檢測動物飼料原料，而且要檢測最終產品。為此世界各國都規定了牛乳及其制品中黃曲霉毒素M1的最大允許含量并將其作為強制性標準，如中國政府規定牛乳及其制品(消毒牛奶、新鮮生牛乳、全脂牛奶粉、淡煉乳、甜煉乳、奶油)中黃曲霉毒素M1的最高允許含量為0.5?ng/mL。

現有技術中常用的黃曲霉毒素檢測技術主要有薄層層析法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、免疫學分析法。前兩者具有樣品前處理步驟繁瑣，耗時費力，儀器價格昂貴，需要專業人員操作等的缺點，而免疫學分析法具有特異性強、樣品前處理簡單、成本低、對實驗人員和環境的污染危害小等優點。最常用的免疫學分析法有酶聯免疫吸附法、納米金免疫層析法等。目前已有黃曲霉毒素M1?的ELISA試劑盒問世，如德國拜發R-Biopharm公司以及美國Abraxis公司等研發的黃曲霉毒素M1?ELISA檢測試劑盒。而基于納米金的免疫層析快速檢測技術因其更短的檢測時間和更簡單的樣品前處理而顯示出更大的應用價值和應用前景。但目前世界上還沒有針對黃曲霉毒素M1免疫層析試紙條問世。因此，研究建立一種針對黃曲霉毒素M1免疫層析試紙條對于監控黃曲霉毒素M1的含量具有很重要的意義和應用價值。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種黃曲霉毒素M1免疫層析試紙條及其制備方法。該試紙條用于檢測黃曲霉毒素M1，具有檢測快速、操作簡單、靈敏度高的特點。

本發明為解決上述技術問題所采用的技術方案為：

黃曲霉毒素M1免疫層析試紙條（見圖1和圖2），包括紙板，紙板的一面從上到下依次粘貼吸水墊、檢測墊、金標墊和樣品墊，相鄰各墊在連接處交疊連接，所述檢測墊以硝酸纖維素膜為基墊，硝酸纖維素膜上自上而下設置橫向質控線和檢測線，所述檢測線包被有黃曲霉毒素M1-牛血清白蛋白偶聯物(AFM1-BSA)，質控線包被有兔抗鼠多克隆抗體；所述金標墊橫向噴涂有納米金標記的抗黃曲霉毒素M1單克隆抗體，所述抗黃曲霉毒素M1單克隆抗體由保藏號為CCTCC?NO.?C201018的雜交瘤細胞株2C9產生。

所述的雜交瘤細胞株2C9已于2010年7月13日保藏于中國典型培養物保藏中心（CCTCC），保藏地址是，中國，武漢，武漢大學，保藏編號為CCTCC?NO.?C201018。其具有序列表中SEQ?Gene?No.1所示的抗黃曲霉毒素M1單克隆抗體重鏈可變區編碼基因序列和序列表中SEQ?Gene?No.2所示的抗黃曲霉毒素M1單克隆抗體輕鏈可變區編碼基因序列。

抗黃曲霉毒素M1單克隆抗體，它由保藏編號為CCTCC?NO.?C201018的雜交瘤細胞株2C9分泌產生。其重鏈可變區具有序列表中SEQ?Protein?No.1所示的氨基酸序列；輕鏈可變區具有序列表中SEQ?Protein?No.2所示的氨基酸序列。該抗黃曲霉毒素M1單克隆抗體可以識別黃曲霉毒素M1，對黃曲霉毒素M1的50%抑制濃度IC_50?為67?pg/mL。

本發明采用的抗黃曲霉毒素M1單克隆抗體的制備方法，步驟如下：

（1）采用兩步篩選法獲得雜交瘤細胞株2C9：將BALB/c小鼠經黃曲霉毒素完全抗原AFM1-BSA免疫4-6次后，用2倍于前一次免疫劑量的黃曲霉毒素完全抗原AFM1-BSA作最后一次加強免疫，3天后進行細胞融合，采用ELISA方法分兩步進行篩選融合細胞：第一步采用間接ELISA法篩選出抗黃曲霉毒素而不抗載體蛋白BSA的陽性孔；第二步采用間接競爭ELISA法對第一步篩選出的陽性孔培養液進行檢測，用黃曲霉毒素M1作為競爭原，選擇吸光值和靈敏度均較高的孔，采用有限稀釋法進行克隆，克隆后10天左右采用同樣的兩步篩選法進行檢測，如此重復克隆2-3次后，最終篩選獲得雜交瘤細胞株2C9；

（2）將獲得的雜交瘤細胞株2C9注射預先用福氏不完全佐劑處理過的BALB/c小鼠，收集該小鼠的腹水，純化即得抗黃曲霉毒素M1單克隆抗體。