[發明專利]刺參體腔細胞吞噬活性的流式細胞檢測方法

無效

• 申請號: 201110062287.7
• 申請日: 2011-03-08
• 公開（公告）號: CN102279147A
• 公開（公告）日: 2011-12-14
• 發明（設計）人: 劉洪展;鄭風榮;屈佩;孫修勤
• 申請（專利權）人: 山東大學威海分校
• 主分類號: G01N15/14
• 分類號: G01N15/14
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種刺參體腔細胞吞噬活性的流式細胞檢測方法，屬于海洋生物技術領域。

背景技術

由于刺參市場需求量的逐年增加，傳統的捕撈業已不能滿足人們的需求，刺參養殖業應運而生，養殖面積和產量的迅速增加，為沿海地區創造了十分可觀的社會效益和經濟效益。但近年來刺參病害不斷發生，自2003年冬季起，山東和遼寧沿海的養殖刺參先后出現了爛皮、腫嘴的大面積流行病、引發了30％以上的大量死亡。免疫學研究，是了解機體免疫反應特征、從而為疾病防治奠定基礎和提供方法的科學。然而，由于刺參大量養殖是近幾年的事，而病害的發生也非常急驟，所以免疫防御研究嚴重滯后。

棘皮動物的體腔細胞具有多種生理功能，包括自我和非自我識別、吞噬、細胞毒素反應、細胞聚合、包囊、凝血以及產生抗菌活性物質等。細胞吞噬作用是棘皮動物免疫防御的主要效應方式，對體內沒有產生抗體機構的棘皮動物的免疫防御具有更為重要的意義，這一指標被廣泛的用于衡量機體的健康狀況及在環境脅迫或病原脅迫下的免疫防御能力。目前有多種測定細胞吞噬的方法，如傳統的顯微鏡檢計數法、光密度法及流式細胞儀熒光檢測法等。其中，鏡檢法通過顯微鏡的觀察分析，適用于細胞的形態學觀察及單個細胞吞噬功能的定性研究，但由于該技術存在主觀性強和重復性差等缺點，其應用在一定程度上受到了限制。流式細胞儀技術(Flow-cytometry，FCM)可利用不同的熒光標記對細胞的吞噬功能進行研究，具有準確性高、重復性好，而且操作簡便快速的特點，目前已成為研究脊椎動物血細胞功能的常規手段，但其在棘皮動物類中尚未得到廣泛應用。

發明內容

本發明解決的技術問題是，解決上述現有技術的不足，提供一種快速測定刺參體腔細胞吞噬活性的流式細胞檢測方法，該方法具有準確性高、重復性好，而且操作簡便快速的特點。

本發明的技術方案是，首先制備刺參體腔液中的吞噬細胞，然后用熒光素異硫氰酸酯(FITC)標記熱滅活后的酵母細胞，再將標記后的酵母細胞與刺參吞噬細胞共孵育，最后利用流式細胞儀測定吞噬活性。

具體包括以下步驟：

(1)制備刺參體腔液中的吞噬細胞：無菌注射器抽取與抗凝劑等體積的刺參體腔液，放入無菌離心管中，再沿管壁緩慢加入與混合液體積相同的蔗糖緩沖液，在水平離心機800-1200rpm離心5-10分鐘，收集位于體腔液、抗凝液混合物與蔗糖緩沖液之間的吞噬細胞，收集后用等滲緩沖液洗1-2次，加入含10％胎牛血清和1％雙抗的L-15培養基，調整細胞濃度數量級為10⁶cfu/mL。

(2)FITC標記酵母細胞：將劃線分離的酵母細胞單克隆接種于YDP液體培養基，26℃-28℃，振蕩培養12-16小時后，室溫5000-8000rpm離心10-20分鐘，收集酵母細胞，并用PBS洗1-2次，再用PBS重懸定量至1×10⁹cfu/mL，放入沸水浴中30-50分鐘殺死酵母細胞，然后用PBS沖洗2-3次，離心棄上清，PBS重懸，在37℃避光與FITC共同培養30-40分鐘，濃度為0.01mgFITC/10⁹酵母細胞，其間不時搖勻，室溫離心收集標記酵母細胞，PBS洗2-3次至上清無色，然后懸浮于等滲緩沖液中，定量1×10⁸cfu/mL，熒光顯微鏡觀察標記情況，4℃避光貯存。

(3)標記后的酵母細胞與刺參吞噬細胞的共孵育：加FITC標記的酵母細胞于吞噬細胞培養液中，且標記的酵母細胞與吞噬細胞的比例約為30-50∶1，室溫，置于水平搖床上慢速搖動30-120分鐘，取搖勻液800-1000rpm離心5-10分鐘，棄上清，PBS洗一次，70％乙醇固定10-15分鐘，800-1000rpm離心5-10分鐘后棄上清，沉淀加入1mL濃度為0.5μg/mL的EB。

(4)利用流式細胞儀檢測吞噬細胞體外吞噬活性：所用流式細胞儀為BD公司生產的，型號為FACSCalibur，設定儀器基本參數，前向角為460，側向角為399，起始電壓0，數據采用Log對數形式，上樣后先用FSc-H/Ssc-H圈定巨噬細胞，再采集紅色和綠色熒光強度，并計算實際吞噬率，所得數據用CellQuestPro?Software軟件分析。

本發明所述的抗凝劑用以下方法制得：先配置pH7.6的濃度為0.068mol/L的Tris-HCl緩沖液，然后加入0.02mol/L的EGTA，0.34mol/L的NaCl，0.018mol/L的KCl，最后用0.22μm的濾器過濾即可。