[發明專利]刺參體腔細胞吞噬活性的流式細胞檢測方法

無效

• 申請號: 201110062287.7
• 申請日: 2011-03-08
• 公開（公告）號: CN102279147A
• 公開（公告）日: 2011-12-14
• 發明（設計）人: 劉洪展;鄭風榮;屈佩;孫修勤
• 申請（專利權）人: 山東大學威海分校
• 主分類號: G01N15/14
• 分類號: G01N15/14
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.刺參體腔細胞吞噬活性的流式細胞檢測方法，其特征在于，首先制備刺參體腔液中的吞噬細胞，然后用熒光素異硫氰酸酯FITC標記熱滅活后的酵母細胞，再將標記后的酵母細胞與刺參吞噬細胞共孵育，最后利用流式細胞儀測定吞噬活性。

2.根據權利要求1所述的刺參體腔細胞吞噬活性的流式細胞檢測方法，其特征在于，具體包括以下步驟：

(1)制備刺參體腔液中的吞噬細胞：無菌注射器抽取與抗凝劑等體積的刺參體腔液，放入無菌離心管中，再沿管壁緩慢加入與混合液體積相同的蔗糖緩沖液，在水平離心機800-1200rpm離心5-10分鐘，收集位于體腔液、抗凝液混合物與蔗糖緩沖液之間的吞噬細胞，收集后用等滲緩沖液洗1-2次，加入含10％胎牛血清和1％雙抗的L-15培養基，調整細胞濃度數量級為10⁶cfu/mL；

(2)FITC標記酵母細胞：將劃線分離的酵母細胞單克隆接種于YDP液體培養基，26℃或28℃，振蕩培養12-16小時后，室溫5000-8000rpm離心10-20分鐘，收集酵母細胞，并用PBS洗1-2次，再用PBS重懸定量至1×10⁹cfu/mL，放入沸水浴中30-50分鐘殺死酵母細胞，然后用PBS沖洗2-3次，離心棄上清，PBS重懸，在37℃避光與FITC共同培養30-40分鐘，濃度為0.01mgFITC/10⁹酵母細胞，其間不時搖勻，室溫離心收集標記酵母細胞，PBS洗2-3次至上清無色，然后懸浮于等滲緩沖液中，定量1×10⁸cfu/mL，熒光顯微鏡觀察標記情況，4℃避光貯存；

(3)標記后的酵母細胞與刺參吞噬細胞的共孵育：加FITC標記的酵母細胞于吞噬細胞培養液中，且標記的酵母細胞與吞噬細胞的比例為30-50∶1，室溫，置于水平搖床上慢速搖動30-120分鐘，取搖勻液800-1000rpm離心5-10分鐘，棄上清，PBS洗一次，70％乙醇固定10-15分鐘，800-1000rpm離心5-10分鐘后棄上清，沉淀加入1mL濃度為0.5μg/mL的EB；

(4)利用流式細胞儀檢測吞噬細胞體外吞噬活性：所用流式細胞儀為BD公司生產的，型號為FACSCalibur，設定儀器基本參數，前向角為460，側向角為399，起始電壓0，數據采用Log對數形式，上樣后先用FSc-H/Ssc-H圈定巨噬細胞，再采集紅色和綠色熒光強度，并計算實際吞噬率，所得數據用CellQuest?Pro?Software軟件分析。

3.根據權利要求2所述的刺參體腔細胞吞噬活性的流式細胞檢測方法，其特征在于，所述的抗凝劑用以下方法制得：先配置pH7.6的濃度為0.068mol/L的Tris-HCl緩沖液，然后加入0.02mol/L的EGTA，0.34mol/L的NaCl，0.018mol/L的KCl，最后用0.22μm的濾器過濾即可。

4.根據權利要求2所述的刺參體腔細胞吞噬活性的流式細胞檢測方法，其特征在于，所述的蔗糖緩沖液用以下方法制得：先配置pH7.6的濃度為0.001mol/L的Tris-HCl緩沖液，然后加入0.8mol/L的蔗糖，0.34mol/L的NaCl，0.001mol/L的EGTA，最后用0.22μm的濾器過濾即可。

5.根據權利要求2所述的刺參體腔細胞吞噬活性的流式細胞檢測方法，其特征在于，所述的等滲緩沖液用以下方法制得：先配置pH7.6的濃度為0.01mol/L的Tris-HCl緩沖液，然后加入0.01mol/L的EGTA，0.34mol/L的NaCl，最后用0.22μm的濾器過濾即可。

6.根據權利要求2所述的刺參體腔細胞吞噬活性的流式細胞檢測方法，其特征在于，所述的雙抗內含100IU/ml的青霉素及100μg/ml的鏈素。

7.根據權利要求2所述的刺參體腔細胞吞噬活性的流式細胞檢測方法，其特征在于，所述的YDP液體培養基由1％的酵母浸出汁，2％蛋白胨，2％的D-葡萄糖混合，然后滅菌制得。