[發明專利]花生Δ12-脂肪酸脫氫酶基因快速分型方法

無效

• 申請號: 201110058563.2
• 申請日: 2011-03-11
• 公開（公告）號: CN102199661A
• 公開（公告）日: 2011-09-28
• 發明（設計）人: 王傳堂;于洪濤;唐月異;王秀貞;楊偉強;張建成;禹山林;髙華援;張樹偉;李貴杰
• 申請（專利權）人: 山東省花生研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 青島發思特專利商標代理有限公司 37212
• 代理人: 鞏同海

技術領域

本發明設計了一種農作物基因快速分型方法，尤其涉及一種花生基因的快速分型方法。

背景技術

花生是我國重要的油料作物和出口商品，有研究表明，油酸含量高的花生油可以有效降低人體內有害膽固醇水平，而不產生副作用。在花生中Δ¹²-脂肪酸脫氫酶(FAD2)的功能是催化油酸脫氫，使之轉化成具有兩個雙鍵的亞油酸。通常情況下，脂肪酸分子上雙鍵越多越易氧化變質，食品保質期越短。而且亞油酸既能降低人體內有害膽固醇的含量，也能降低有益膽固醇含量，因此，培育高油酸/亞油酸比值的花生品種，使FAD2的酶活性降低，大大提高花生中油酸的含量，成為當前花生育種工作中的重要目標之一。

花生是異源四倍體植物，FAD2A基因和FAD2B基因分別來自兩套基因組，兩基因的序列高度相似。目前，國內外已報道獲得了油酸/亞油酸比值異常高的高油酸花生突變品系。經檢測，其中的FAD2A和FAD2B基因均已發生突變。FAD2A基因發生錯義突變，編碼區第448位堿基由G突變為A(即FAD2A?448G＞A)；FAD2B基因突變最常見的一種情況是編碼區第442位插入一個A，導致移碼突變(即FAD2B?441_442insA)。兩個基因所編碼的酶活性大幅降低，因此表現為高油酸性狀；FAD2A和FAD2B的等位基因中只要有一個是正常的，便不會出現高油酸性狀。此種花生高油酸突變體在育種工作中可作為親本與具有其他優良性狀的材料雜交，以培育同時具有高油酸性狀和高產、抗逆或高油等優良性狀的花生品種。

從育種應用的角度看，在正常油酸×高油酸(FAD2A?448G＞A和FAD2B441_442insA)花生雜交組合中，需要從F₁(或F_0∶1)和F₂(或F_1∶2)雜交后代中選擇出同時具有FAD2A和FAD2B突變型基因的真實雜種個體。在此將FAD2A野生型基因表示為A，突變的等位基因表示為a；將FAD2B野生型基因表示為B，突變等位基因表示為b。具有Aa/aa/Bb/bb基因型的個體，即為我們所要選擇保留的真實雜種。目前，在花生高油酸育種上應用的選擇技術主要有SSR標記、qPCR法、CAPS標記法、直接測序法、AS-PCR法以及近紅外光譜掃描法等，前3種方法操作步驟繁瑣或需要特殊的設備，直接測序雖可以確定基因型但價格不菲，當后代群體數目龐大時費用之高難以承受。通過等位基因特異PCR(AS-PCR)的方法來檢測花生FAD2A和FAD2B基因型已有報道，但在應用上具有局限性，難以區分AaBB和aaBB、AABb和AAbb基因型。近紅外光譜掃描不能識別F₂代同時具備FAD2A、FAD2B突變基因而這兩個基因尚未純合的材料。

發明內容

本發明的技術效果能夠克服上述缺陷，提供一種花生Δ¹²-脂肪酸脫氫酶快速分型方法，其可以通過一次實驗過程得出大量雜交后代的基因型。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案，其包括如下步驟：

(1)針對脂肪酸脫氫酶FAD2A、FAD2B的野生型和突變型基因各設計一套PCR引物組合和檢測體系；

(2)采用通用的PCR反應程序；

(3)瓊脂糖凝膠檢測判讀個體的基因型，每個檢測體系中出現一條1241bp的內參帶，標志PCR反應程序成功。

根據FAD2A和FAD2B基因之間的序列差異以及兩基因自身野生型和突變型等位基因之間的序列差異，設計了專門用來分別檢測這4個等位基因的PCR引物組合。對4個等位基因分別設置25μl?PCR檢測體系，簡述如下。體系(1)檢測FAD2A野生型等位基因：2×Taq?PCR?MasterMix?12.5μl；

引物FAD2A-F：1μl；

引物FAD2A-G：1μl；

引物FAD2-R：0.1-0.8μl；

模板DNA：＜1μg；

ddH₂O：補至25μl。

體系(2)檢測FAD2A突變型等位基因：2×Taq?PCR?MasterMix??12.5μl；

引物FAD2A-F：1μl；

引物FAD2A-A：1μl；

引物FAD2-R：0.1-0.8μl；

模板DNA：＜1μg；

ddH₂O：補至25μl。

體系(3)檢測FAD2B野生型等位基因：2×Taq?PCR?MasterMix?12.5μl；