[發明專利]一種CD133高表達鼠肝腫瘤細胞系及制備方法

有效

• 申請號: 201110056613.3
• 申請日: 2011-03-09
• 公開（公告）號: CN102181399A
• 公開（公告）日: 2011-09-14
• 發明（設計）人: 劉永忠;楊兆娟;馬愛輝;張力;劉蘭蘭
• 申請（專利權）人: 上海市腫瘤研究所
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N5/073;C12N7/00;C12R1/91
• 代理公司: 上海天翔知識產權代理有限公司 31224
• 代理人: 呂伴

技術領域

本發明涉及一種腫瘤細胞治療領域，具體涉及一種高表達CD133的鼠肝腫瘤細胞系及其制備方法。

背景技術

近年來，越來越多的研究表明，在腫瘤細胞中存在一部分占極少比例的干細胞群，被稱為腫瘤干細胞(cancer?stem?cells，CSCs)，這群細胞在腫瘤治療抗性、復發和惡性轉移中起關鍵作用。腫瘤干細胞具有與普通干細胞相似的無限增殖、自我更新等能力；表達干細胞的標志，如：CD133、EpCAM、CD44、CD90、CD24、CXCR4、ALDH1等；表達調節干性相關因子，如：Notch、Bmi1、Oct4、Nanog等。腫瘤干細胞雖然數量稀少，但是卻具有高致瘤性并維持腫瘤生長與轉移。原代分離的腫瘤細胞中，僅表達干細胞標志的少數細胞能夠啟動腫瘤的發生、發展。因此，靶向清除CSCs應該是今后有效治療腫瘤的最佳策略。為此，需要一個較好的研究CSCs的工具，以研究腫瘤發生及發展的機理并開發靶向CSCs的藥物。

肝癌是目前人類比較常見的腫瘤之一，其發病率在全世界范圍內排第六位，而其死亡率則排在第三位。我國是肝癌的高發區，而且近年其發病率呈上升趨勢。因此建立可靠有效的研究肝癌發生及發展的機制、開發有效靶向肝癌干細胞的治療藥物的肝癌研究工具成為當前急需解決的問題。目前，肝癌模型的建立主要有化學藥物誘導、基因改造以及小鼠體內接種肝癌細胞等方法。化學藥物誘導形成肝腫瘤的方法存在實驗周期長、個體差異性大以及相關基因不明晰等問題；特定基因改造后的小鼠也可產生肝癌，雖然這種模型的分子機制明確，但是存在建立或引進動物品系困難以及實驗周期長等缺點；在小鼠體內接種肝癌細胞是一種操作簡單易行的方法，但是缺少細胞發生轉化繼而形成腫瘤的完整癌變過程。Zender?L等人通過在胚胎肝前體細胞中導入癌基因信號使其可形成肝癌，這種動物模型具有相對完整的細胞轉化及腫瘤形成的過程、且實驗周期短等特點，有利于對肝癌相關基因或信號通路的研究。但是這種導入癌基因?信號的胚胎肝前體細胞中所含表達干細胞標志物CD133的腫瘤干細胞數量稀少，對于有效研究CSCs在肝癌發生及發展過程中的作用存在較大的局限性。縱觀國內外，目前缺少良好的研究肝癌干細胞在肝癌發生及發展過程中的作用的實驗平臺。

發明內容

本發明所要解決的技術問題之一是針對目前腫瘤細胞系中表達干細胞標志物CD133的腫瘤干細胞數量稀少的問題，提供一種高表達CD133的鼠肝腫瘤細胞系LPC-H12，該腫瘤細胞系已于2010年12月8日保藏于中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏號為CCTCC?No.C2010115，生物材料樣品名稱：小鼠肝腫瘤細胞LPC-H12，保藏單位地址：中國.武漢.武漢大學。

本發明所要解決的技術問題之二是提供一種高表達CD133的鼠肝腫瘤細胞系的制備方法

作為本發明所要解決的技術問題之一，一種高表達CD133的鼠肝腫瘤細胞系LPC-H12可以通過以下技術方案來實現：

在p53-/-小鼠胚胎肝細胞中導入癌基因Hras后，通過單克隆打板技術得到源于CD133+細胞的單細胞克隆群，最后通過篩選建立含高比率CD133+細胞亞群的鼠肝腫瘤細胞系。

具體技術方案如下：

建立CD133高表達的鼠肝腫瘤細胞系：

a)分離p53-/-小鼠胚胎肝細胞(LPC細胞)：取E13.5d的p53-/-小鼠胚胎，在PBS中漂洗2-3次；用無菌眼科剪及鑷子完整剪取其肝臟。將其剪碎后，加入肝臟消化液于37℃消化30min成單細胞懸液。離心去上清，用PBS洗2-3次，將細胞與大鼠抗小鼠E-cadherin單抗一起4℃孵育30min(所用抗體量為4ug?E-cadherin/1×10⁷個細胞)。用PBS洗2-3次，離心去上清，將細胞與羊抗大鼠的磁珠(20ul/l×10⁸細胞)一起4℃孵育15min。最后采用磁珠分選系統(MACS)分離出E-cadherin+胚胎肝細胞。分離出的細胞接種于預先鋪有明膠的細胞培養皿中，采用含10％胎牛血清、0.01M尼古丁、10^-7mol/L地塞米松、1×ITS、1×巰基乙醇、40ng/ml的HGF、20ng/ml的EGF、100U/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素的DMEM/F12培養液，于37℃、5％二氧化碳/95％空氣的恒溫培養箱中進行培養。