[發(fā)明專利]一種CD133高表達(dá)鼠肝腫瘤細(xì)胞系及制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110056613.3
• 申請日: 2011-03-09
• 公開（公告）號: CN102181399A
• 公開（公告）日: 2011-09-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉永忠;楊兆娟;馬愛輝;張力;劉蘭蘭
• 申請（專利權(quán)）人: 上海市腫瘤研究所
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N5/073;C12N7/00;C12R1/91
• 代理公司: 上海天翔知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31224
• 代理人: 呂伴

1.一種高表達(dá)CD133的鼠肝腫瘤細(xì)胞系，其特征在于，該細(xì)胞系為一種具有干細(xì)胞標(biāo)志物CD133高表達(dá)量特性的鼠肝腫瘤細(xì)胞系。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高表達(dá)CD133的鼠肝腫瘤細(xì)胞系，其特征在于，所述細(xì)胞系于2010年12月16日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC?No.C2010115。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高表達(dá)CD133的鼠肝腫瘤細(xì)胞系，其特征在于，其建立過程具體包含如下步驟：

a)分離p53-/-小鼠胚胎肝細(xì)胞(LPC細(xì)胞)：取E13.5d的p53-/-小鼠胚胎，在PBS中漂洗2-3次；用無菌眼科剪及鑷子完整剪取其肝臟。將其剪碎后，加入肝臟消化液于37℃消化30min成單細(xì)胞懸液。離心去上清，用PBS洗2-3次，將細(xì)胞與大鼠抗小鼠E-cadherin單抗一起4℃孵育30min(所用抗體量為4ug?E-cadherin/1×10⁷個細(xì)胞)。用PBS洗2-3次，離心去上清，將細(xì)胞與羊抗大鼠的磁珠(20ul/l×10⁸細(xì)胞)一起4℃孵育15min。最后采用磁珠分選系統(tǒng)(MACS)分離出E-cadherin+胚胎肝細(xì)胞。分離出的細(xì)胞接種于預(yù)先鋪有明膠的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，采用含10％胎牛血清、0.01M尼古丁、10^-7mol/L地塞米松、1×ITS、1×巰基乙醇、40ng/ml的HGF、20ng/ml的EGF、100U/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液，于37℃、5％二氧化碳/95％空氣的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

b)MSCV-IRES-GFP-Hras(MIG-Hras)逆轉(zhuǎn)錄病毒的制備：按照invitrogen公司lipofectAMINE^TM2000?Reagent說明書提供的參考方法進(jìn)行操作，將MIG-Hras質(zhì)粒轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞Ecotropic中，培養(yǎng)48及72h后分別收集病毒上清。

c)LPC-H鼠肝腫瘤細(xì)胞系的建立：感染LPC細(xì)胞前一天，將LPC細(xì)胞接種于預(yù)先鋪有明膠的24孔板中(5×10³個細(xì)胞/孔)。感染時去培養(yǎng)液，加入b)中的病毒上清，每隔8h更換一次病毒上清，持續(xù)感染24h。去病毒，加入新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液，隔天換液，每三天傳代一次。收集1×10⁵～1×10⁷的細(xì)胞通過流式分選帶GFP熒光的細(xì)胞，于新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液中擴(kuò)大培養(yǎng)。

d)含高比率CD133+細(xì)胞亞群并具有高致瘤性的鼠肝腫瘤細(xì)胞系的建立：將LPC-H鼠肝腫瘤細(xì)胞系培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用0.25％胰酶+0.1％EDTA消化后，PBS洗滌兩次，取1×10⁵～1×10⁷的細(xì)胞放入流式管中，離心去上清，加入100μl的10％山羊血清懸浮細(xì)胞，4℃封閉10min。隨后加入帶PE熒光的小鼠CD133抗體2.5ul(0.5mg/ml)，4℃孵育30min。用FACS緩沖液(PBS+0.5％BSA)洗滌兩次，棄上清，加入1ml細(xì)胞培養(yǎng)液，通過流式分選儀將單個帶GFP熒光、CD133+的LPC-H細(xì)胞打入加有新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液的96孔板中。于37℃、5％二氧化碳/95％空氣的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。7-14d后，待各單個細(xì)胞擴(kuò)增起來后，移入24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至生長對數(shù)期，各單克隆取一部分細(xì)胞進(jìn)行CD133表達(dá)的檢測，篩選得到高表達(dá)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD133的鼠肝腫瘤細(xì)胞系LPC-H12。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高表達(dá)CD133的鼠肝腫瘤細(xì)胞系，其特征在于，所述細(xì)胞系為一種對干細(xì)胞標(biāo)志物CD133及EpCAM的表達(dá)量均高于初始細(xì)胞系LPC-H的鼠肝腫瘤細(xì)胞系。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高表達(dá)CD133的鼠肝腫瘤細(xì)胞系，其特征在于，所述細(xì)胞系為一種表達(dá)與干細(xì)胞相關(guān)的基因Alb、AFP、CK19、Bmi1、ALDH1a1、SOX1、Nanog、Notch1中的一種或多種的鼠肝腫瘤細(xì)胞系。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述，一種高表達(dá)CD133的鼠肝腫瘤細(xì)胞系，其特征在于，所述細(xì)胞系為一種較之初始細(xì)胞系LPC-H，具有體外高成球能力的鼠肝腫瘤細(xì)胞系。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高表達(dá)CD133的鼠肝腫瘤細(xì)胞系，其特征在于，所述細(xì)胞系為一種較之初始細(xì)胞系LPC-H，具有體內(nèi)高致瘤能力的鼠肝腫瘤細(xì)胞系。

8.一種高表達(dá)CD133的鼠肝腫瘤細(xì)胞系的制備方法，其特征在于，所述方法具體包括如下步驟：

a)分離p53-/-小鼠胚胎肝細(xì)胞(LPC細(xì)胞)：取E13.5d的p53-/-小鼠胚胎，在PBS中漂洗2-3次；用無菌眼科剪及鑷子完整剪取其肝臟。將其剪碎后，加入肝臟消化液于37℃消化30min成單細(xì)胞懸液。離心去上清，用PBS洗2-3次，將細(xì)胞與大鼠抗小鼠E-cadherin單抗一起4℃孵育30min(所用抗體量為4ug?E-cadherin/1×10⁷個細(xì)胞)。用PBS洗2-3次，離心去上清，將細(xì)胞與羊抗大鼠的磁珠(20ul/l×10⁸細(xì)胞)一起4℃孵育15min。最后采用磁珠分選系統(tǒng)(MACS)分離出E-cadherin+胚胎肝細(xì)胞。分離出的細(xì)胞接種于預(yù)先鋪有明膠的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，采用含10％胎牛血清、0.01M尼古丁、10^-7mol/L地塞米松、1×ITS、1×巰基乙醇、40ng/ml的HGF、20ng/ml的EGF、100U/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液，于37℃、5％二氧化碳/95％空氣的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

b)MSCV-IRES-GFP-Hras(MIG-Hras)逆轉(zhuǎn)錄病毒的制備：按照invitrogen公司lipofectAMINE^TM2000?Reagent說明書提供的參考方法進(jìn)行操作，將MIG-Hras質(zhì)粒轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞Ecotropic中，培養(yǎng)48及72h后分別收集病毒上清。

c)LPC-H鼠肝腫瘤細(xì)胞系的建立：感染LPC細(xì)胞前一天，將LPC細(xì)胞接種于預(yù)先鋪有明膠的24孔板中(5×10³個細(xì)胞/孔)。感染時去培養(yǎng)液，加入b)中的病毒上清，每隔8h更換一次病毒上清，持續(xù)感染24h。去病毒，加入新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液，隔天換液，每三天傳代一次。收集1×10⁵～1×10⁷的細(xì)胞通過流式分選帶GFP熒光的細(xì)胞，于新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液中擴(kuò)大培養(yǎng)。

d)含高比率CD133+細(xì)胞亞群并具有高致瘤性的鼠肝腫瘤細(xì)胞系的建立：將LPC-H鼠肝腫瘤細(xì)胞系培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用0.25％胰酶+0.1％EDTA消化后，PBS洗滌兩次，取1×10⁵～1×10⁷的細(xì)胞放入流式管中，離心去上清，加入100μl的10％山羊血清懸浮細(xì)胞，4℃封閉10min。隨后加入帶PE熒光的小鼠CD133抗體2.5ul(0.5mg/ml)，4℃孵育30min。用FACS緩沖液(PBS+0.5％BSA)洗滌兩次，棄上清，加入1ml細(xì)胞培養(yǎng)液，通過流式分選儀將單個帶GFP熒光、CD133+的LPC-H細(xì)胞打入加有新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液的96孔板中。于37℃、5％二氧化碳/95％空氣的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。7-14d后，待各單個細(xì)胞擴(kuò)增起來后，移入24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至生長對數(shù)期，各單克隆取一部分細(xì)胞進(jìn)行CD133表達(dá)的檢測，篩選得到高表達(dá)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD133的鼠肝腫瘤細(xì)胞系LPC-H12。