[發(fā)明專利]從禽多殺性巴氏桿菌提取脂多糖并制作脂多糖疫苗的方法

無效

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• 申請日: 2011-03-09
• 公開（公告）號: CN102120028A
• 公開（公告）日: 2011-07-13
• 發(fā)明（設計）人: 宮強;王帥濤;張敏;牛明福;孫軍杰;秦翠麗;李愛江
• 申請（專利權）人: 河南科技大學
• 主分類號: A61K39/102
• 分類號: A61K39/102;C12N1/20;C08B37/00;A61P31/04
• 代理公司: 洛陽市凱旋專利事務所 41112
• 代理人: 符繼超

技術領域

本發(fā)明屬于動物疫苗制備技術領域，尤其是一種從禽多殺性巴氏桿菌提取脂多糖并制作脂多糖疫苗的方法。

背景技術

禽多殺性巴氏桿菌病是由禽多殺性巴氏桿菌引起的家禽接觸性傳染病，呈世界分布，在我國也是常見的多發(fā)性傳染病，幾乎所有的家禽都能感染該病，其傳染流行嚴重影響著家禽業(yè)的健康發(fā)展。

目前我國對于禽多殺性巴氏桿菌病的預防和治療主要采用的是藥物治療，如抗生素等，但一旦停藥后容易復發(fā)，且長期用藥容易誘導禽多殺性巴氏桿菌產(chǎn)生耐藥性，還可能產(chǎn)生副作用，比如會引起產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋率的下降。因此，為了更加有效地預防禽多殺性巴氏桿菌病的流行，需要用有效的疫苗進行免疫。

禽多殺性巴氏桿菌病的常規(guī)疫苗主要有弱毒活疫苗和滅活疫苗兩種，但是弱毒活疫苗存在一定的缺點，比如免疫持續(xù)期比較短、保護效果偏低、副作用偏大，應用不當時會引起免疫失敗，甚至會造成一些家禽的死亡。

而滅活疫苗在滅活過程中可能造成某些抗原物質的丟失，只能對同血清型的菌株感染有一定的免疫效果，且保護效果和免疫持續(xù)期還不如弱毒活疫苗更好。

脂多糖是禽多殺性巴氏桿菌內毒素的物質基礎，在禽多殺性巴氏桿菌崩裂時釋放出來，是很強的發(fā)熱原。目前人們普遍認為脂多糖在禽多殺性巴氏桿菌的致病過程中起著重要的作用。研究表明禽多殺性巴氏桿菌的脂多糖在對嗜中性粒細胞的黏附中起著輔助作用。從血清型為B:2的禽多殺性巴氏桿菌菌株中分離到的脂多糖能夠引起動物產(chǎn)生出血性敗血癥的癥狀。除了具有致病性外，禽多殺性巴氏桿菌的脂多糖還能夠誘發(fā)體液免疫應答，因此被認為是一種保護性抗原。

截止目前，從禽多殺性巴氏桿菌中提取脂多糖并制作禽多殺性巴氏桿菌脂多糖疫苗的方法還未見相關報道。

發(fā)明內容

為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種從禽多殺性巴氏桿菌提取脂多糖并制作脂多糖疫苗的方法，該方法先從禽多殺性巴氏桿菌中提取脂多糖，然后將提取的脂多糖溶液與弗氏完全佐劑按照1︰1.5的比例進行混合制成禽多殺性巴氏桿菌病脂多糖疫苗，經(jīng)動物實驗驗證表明本方法制備出的禽多殺性巴氏桿菌病脂多糖疫苗可有效地為被免疫的雞提供抵抗禽多殺性巴氏桿菌攻擊的能力，保護率為66.7%，能夠有效地預防家禽產(chǎn)生禽多殺性巴氏桿菌病。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

一種從禽多殺性巴氏桿菌提取脂多糖并制作脂多糖疫苗的方法，該方法經(jīng)過①制備禽多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)液、②從禽多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)液中收集禽多殺性巴氏桿菌菌體、③超聲波對禽多殺性巴氏桿菌菌體進行破碎、④從超聲波破碎的禽多殺性巴氏桿菌菌體中粗提脂多糖溶液、⑤從粗提的脂多糖溶液中提取脂多糖濃縮液、⑥用DNA酶和RNA酶來酶解脂多糖濃縮液中的DNA和RNA、⑦制備純化的脂多糖和⑧將純化的脂多糖制作成禽多殺性巴氏桿菌脂多糖疫苗共八個步驟，上述八個步驟中所述的②中涉及到離心機的離心轉速，所述的③中涉及到超聲波的功率、輻射時間、間歇秒數(shù)和輻射次數(shù)，所述的⑤中涉及到換水次數(shù)，所述的⑥中涉及到酶解時間，所述的⑦中涉及到用濃度為6摩爾/升NaOH來調節(jié)溶液的pH值，所述的⑧中涉及到脂多糖溶液與弗氏完全佐劑的體積比均為常規(guī)實驗技術手段，這些常規(guī)實驗技術手段中的任一項作為單獨實驗條件或許是存在的，但這些常規(guī)實驗技術手段綜合應用在“從禽多殺性巴氏桿菌提取脂多糖并制作脂多糖疫苗的方法”則是必需的。

本發(fā)明從禽多殺性巴氏桿菌提取脂多糖并制作脂多糖疫苗的方法所述的八個步驟分述如下：

①制備禽多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)液

用接種環(huán)刮取一環(huán)斜面保藏的禽多殺性巴氏桿菌，將刮有一環(huán)禽多殺性巴氏桿菌的接種環(huán)以“Z”字型劃線接種于培養(yǎng)平板上，將培養(yǎng)平板放置于37℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24小時，挑取培養(yǎng)24小時后的培養(yǎng)平板上生長的一個單菌落接種于5毫升的液體培養(yǎng)基中，將該5毫升的液體培養(yǎng)基放在37℃的搖床中以160轉/分鐘的速度振蕩培養(yǎng)24小時，再將振蕩培養(yǎng)的5毫升液體培養(yǎng)基全部倒入200毫升的液體培養(yǎng)基中并在37℃的搖床中以160轉/分鐘的速度振蕩培養(yǎng)24小時制備出禽多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)液；

②從禽多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)液中收集禽多殺性巴氏桿菌菌體

將上述①制備出的禽多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)液加入到250毫升的離心管中，將加入禽多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)液的該250毫升離心管放在離心機上并在5000轉/分鐘的轉速下離心15分鐘，然后將離心15分鐘后的250毫升離心管中的上清液棄掉，留在該250毫升離心管中的沉淀物就是所收集的禽多殺性巴氏桿菌菌體；

③超聲波對禽多殺性巴氏桿菌菌體進行破碎