[發明專利]從禽多殺性巴氏桿菌提取脂多糖并制作脂多糖疫苗的方法

無效

• 申請號: 201110055100.0
• 申請日: 2011-03-09
• 公開（公告）號: CN102120028A
• 公開（公告）日: 2011-07-13
• 發明（設計）人: 宮強;王帥濤;張敏;牛明福;孫軍杰;秦翠麗;李愛江
• 申請（專利權）人: 河南科技大學
• 主分類號: A61K39/102
• 分類號: A61K39/102;C12N1/20;C08B37/00;A61P31/04
• 代理公司: 洛陽市凱旋專利事務所 41112
• 代理人: 符繼超

1.一種從禽多殺性巴氏桿菌提取脂多糖并制作脂多糖疫苗的方法，該方法經過①制備禽多殺性巴氏桿菌培養液、②從禽多殺性巴氏桿菌培養液中收集禽多殺性巴氏桿菌菌體、③超聲波對禽多殺性巴氏桿菌菌體進行破碎、④從超聲波破碎的禽多殺性巴氏桿菌菌體中粗提脂多糖溶液、⑤從粗提的脂多糖溶液中提取脂多糖濃縮液、⑥用DNA酶和RNA酶來酶解脂多糖濃縮液中的DNA和RNA、⑦制備純化的脂多糖和⑧將純化的脂多糖制作成禽多殺性巴氏桿菌脂多糖疫苗共八個步驟，上述八個步驟中所述的②中涉及到離心機的離心轉速，所述的③中涉及到超聲波的功率、輻射時間、間歇秒數和輻射次數，所述的⑤中涉及到換水次數，所述的⑥中涉及到酶解時間，所述的⑦中涉及到用濃度為6摩爾/升NaOH來調節溶液的pH值，所述的⑧中涉及到脂多糖溶液與弗氏完全佐劑的體積比均為常規實驗技術手段，這些常規實驗技術手段中的任一項作為單獨實驗條件或許是存在的，但這些常規實驗技術手段綜合應用在“從禽多殺性巴氏桿菌提取脂多糖并制作脂多糖疫苗的方法”則是必需的；其特征是：所述的八個步驟分述如下：

①制備禽多殺性巴氏桿菌培養液

用接種環刮取一環斜面保藏的禽多殺性巴氏桿菌，將刮有一環禽多殺性巴氏桿菌的接種環以“Z”字型劃線接種于培養平板上，將培養平板放置于37℃培養箱內培養24小時，挑取培養24小時后的培養平板上生長的一個單菌落接種于5毫升的液體培養基中，將該5毫升的液體培養基放在37℃的搖床中以160轉/分鐘的速度振蕩培養24小時，再將振蕩培養的5毫升液體培養基全部倒入200毫升的液體培養基中并在37℃的搖床中以160轉/分鐘的速度振蕩培養24小時制備出禽多殺性巴氏桿菌培養液；

②從禽多殺性巴氏桿菌培養液中收集禽多殺性巴氏桿菌菌體

將上述①制備出的禽多殺性巴氏桿菌培養液加入到250毫升的離心管中，將加入禽多殺性巴氏桿菌培養液的該250毫升離心管放在離心機上并在5000轉/分鐘的轉速下離心15分鐘，然后將離心15分鐘后的250毫升離心管中的上清液棄掉，留在該250毫升離心管中的沉淀物就是所收集的禽多殺性巴氏桿菌菌體；

③超聲波對禽多殺性巴氏桿菌菌體進行破碎

在上述②中250毫升離心管所收集的禽多殺性巴氏桿菌菌體中加入10毫升的蒸餾水，然后將該250毫升離心管置于超聲波破碎儀中，設置超聲波破碎儀的功率為500瓦，每超聲波輻射20秒后停止輻射20秒為一個破碎循環過程，所有破碎循環過程共持續30分鐘，30分鐘后該250毫升離心管中得到的就是經超聲波破碎的禽多殺性巴氏桿菌菌體；

④從超聲波破碎的禽多殺性巴氏桿菌菌體中粗提脂多糖溶液

從禽多殺性巴氏桿菌菌體中粗提脂多糖分為三步，三步分述如下：

第一步，提取上述③中經超聲波破碎得到的禽多殺性巴氏桿菌菌體10毫升并加入到50毫升離心管中，然后再向該50毫升離心管中加入10毫升其濃度為90%的苯酚，顛倒該50毫升離心管數次使10毫升禽多殺性巴氏桿菌菌體和10毫升苯酚充分混勻，然后將充分混勻的該50毫升離心管放置在70℃的水浴鍋中加熱并用玻璃棒快速攪拌30分鐘，30分鐘后從水浴鍋中取出該50毫升離心管并在室溫下放置20分鐘，再將該50毫升離心管放在離心機上并在4000轉/分鐘的轉速下離心30分鐘，離心結束后將該50毫升離心管的上層溶液吸取并加入到另一50毫升的三角瓶中、該50毫升離心管中的中層溶液棄掉不要、最后再向該50毫升離心管中的下層溶液中加入蒸餾水補足體積至10毫升待用；

第二步，向第一步中待用的該50毫升離心管中的下層溶液+蒸餾水中加入10毫升其濃度為90%的苯酚，顛倒該50毫升離心管數次使其充分混勻，充分混勻后將該50毫升離心管放置在70℃的水浴鍋中加熱并用玻璃棒快速攪拌30分鐘，30分鐘后從水浴鍋中取出該50毫升離心管并在室溫下放置20分鐘，再將該50毫升離心管放在離心機上并在4000轉/分鐘的轉速下離心30分鐘，離心結束后將該50毫升離心管的上層溶液吸取并加入到第一步中的另一50毫升的三角瓶中存儲、該50毫升離心管中的中層溶液棄掉不要、最后再向該50毫升離心管中的下層溶液中加入蒸餾水補足體積至10毫升準備再次使用；

第三步，重復第二步數次直至將另一50毫升的三角瓶儲滿刻度為止，存儲滿50毫升的另一50毫升三角瓶中的所述上層溶液就是從超聲波破碎的禽多殺性巴氏桿菌菌體中粗提的脂多糖溶液；

⑤從粗提的脂多糖溶液中提取脂多糖濃縮液

將粗提的50毫升脂多糖溶液全部加入到透析袋中，將透析袋放在自來水流水中持續沖洗48小時，再將透析袋放入到蒸餾水中浸泡，每6小時浸泡換一次蒸餾水共換蒸餾水8次，然后將透析袋放入裝有聚乙二醇6000的燒杯中進行濃縮，直到透析袋中的50毫升脂多糖溶液被濃縮到7.5毫升濃縮液為止，透析袋中所述7.5毫升濃縮液即為脂多糖濃縮液；

⑥用DNA酶和RNA酶來酶解脂多糖濃縮液中的DNA和RNA

將上述⑤中的所述7.5毫升脂多糖濃縮液倒入10毫升的離心管中，再向該10毫升離心管中分別加入375微克的DNA酶和RNA酶；將該10毫升離心管放在37℃水浴中放置5小時，再將該10毫升離心管放在100℃水浴中放置10分鐘，放置10分鐘后從100℃水浴中取出該10毫升離心管并冷卻至室溫，在室溫條件下將該10毫升離心管放在離心機上并在3000轉/分鐘的轉速下離心30分鐘，離心30分鐘后將該10毫升離心管中的上清液吸取并倒入另一100毫升的離心管中備用；

⑦制備純化的脂多糖

向上述⑥備用的另一100毫升離心管中加入體積是其上述⑥所述上清液液體6倍的無水乙醇并用6摩爾/升的NaOH調節pH值至9.0，再將該另一100毫升離心管在4℃時放置12小時，然后在離心機上并在6000轉/分鐘的轉速下離心15分鐘，離心15分鐘后將該另一100毫升離心管中的液體倒掉、留在該另一100毫升離心管中的沉淀物即為所制備純化的脂多糖；

⑧將純化的脂多糖制作成禽多殺性巴氏桿菌脂多糖疫苗

在上述⑦另一100毫升離心管中所制備純化的脂多糖中加入1毫升的超純水進行溶解并得到高濃度的脂多糖溶液，用蒽酮法測定所述脂多糖溶液的濃度，緩慢加入超純水至所述脂多糖溶液的濃度達到0.5毫克/毫升為止；

向上述濃度為0.5毫克/毫升的所述脂多糖溶液中倒入50毫升燒杯中，再向該50毫升燒杯中加入體積是所述脂多糖溶液體積1.5倍的弗氏完全佐劑，同時在該50毫升燒杯中放入一磁力棒并在磁力攪拌器作用下攪拌1小時，攪拌1小時后在該50毫升燒杯中的溶液就是制作的禽多殺性巴氏桿菌脂多糖疫苗。