[發明專利]石房蛤毒素人工抗原和抗體及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201110054584.7
• 申請日: 2011-03-08
• 公開（公告）號: CN102206270A
• 公開（公告）日: 2011-10-05
• 發明（設計）人: 周德慶;劉帥帥;趙峰;朱蘭蘭;柳淑芳
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院黃海水產研究所
• 主分類號: C07K14/77
• 分類號: C07K14/77;C07K16/18;C07K16/06;G01N33/543
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 張中南

技術領域

本發明屬于免疫分析技術領域，具體涉及到一種石房蛤毒素人工抗原和抗體及其制備方法和ELISA檢測試劑盒的制備和應用。

背景技術

目前，麻痹性貝類毒素(Paralytic?shellfish?poison，PSP)已成為世界上分布范圍最廣、發生頻率最高、危害程度最大的一類海洋生物毒素，它通過影響鈉離子通道而抑制神經的傳導。而石房蛤毒素(Saxitoxin，STX)為麻痹性貝類毒素的主要成分之一，是四氫嘌呤的一種衍生物，其外部形態是呈白色、吸濕性很強的固體，溶于水，微溶于甲醇和乙醇。STX及天然衍生物所構成的PSP有很高的致死率，STX對成年人輕度中毒量為110μg，致死劑量為540～1000μg，LD₅₀為9μg/kg(小鼠，ip)。

貝類毒素的分析方法主要有小鼠生物測試法、HPLC法及免疫方法等。小鼠生物測試法是是國際上都能接受的唯一的方法。該方法在檢測樣本總毒性方面相當成功，但此種方法不能確知毒素的組成及含量，且重復性差，靈敏度不高。近幾年發展起來的HPLC法及其聯用技術，具有靈敏、高效的特點，能夠提供更多的毒素信息，是PSP毒素檢測的主要手段，但存在成本高，費時，需要較高的儀器設備及分析技術等缺點。而酶聯免疫吸附測定技術(ELISA)具有簡便、快速、靈敏、成本低廉等特點，ELISA法與傳統的動物生物法及色譜方法相比較，更快速經濟，可以滿足大批量樣品的快速篩查需要。

國內對麻痹性貝毒中的膝溝藻毒素(gonyautoxin，GTX)研究的比較多，暨南大學的向軍儉制備了抗麻痹性貝毒素GTX2，3的單克隆抗體，同時也比較了間接競爭和直接競爭ELISA方法的靈敏度和檢出限。但對STX的酶聯免疫吸附法研究還沒有開展。

發明內容

本發明的目的在于提供一種石房蛤毒素人工抗原和抗體及其制備方法和ELISA檢測試劑盒的制備和應用，將制備的抗體用于石房蛤毒素的檢測，以彌補現有技術的不足。

制備抗體的關鍵是制備人工免疫抗原，因為石房蛤毒素是一種相對分子質量只有299的小分子半抗原，沒有抗原性，不能刺激動物體產生相應的抗體，需要和某種大分子的物質偶聯形成完全抗原，小分子的半抗原就成為新的偶聯物的抗原決定簇，這樣小分子物質就具有了抗原性。而制備人工抗原要選擇合適?的載體蛋白，本發明選擇碳化二亞胺法，載體蛋白選用卵清白蛋白(OVA)，將石房蛤毒素上的氨基與卵清白蛋白(OVA)上的羧基相連，采用梯度法透析后得到高純度的石房蛤毒素免疫抗原STX-OVA。同時本發明還選擇用牛血清白蛋白(BSA)來制備包被抗原STX-BSA，在制備ELISA試劑盒時需要用包被抗原包被酶標板。

本發明的技術方案如下：

一、免疫抗原STX-OVA，其結構式為：

免疫抗原STX-OVA和包被抗原STX-BSA的制備方法為：

利用碳化二亞胺法，碳化二亞胺是一種化學性質非常活躍的雙功能試劑，它們既可與半抗原上的羧基又可與半抗原上的氨基縮合。碳化二亞胺先于石房蛤毒素上的氨基結合，再加入載體蛋白，石房蛤毒素上的氨基與體蛋白上的羧基相連，形成酰胺鍵，形成新的復合物，同時碳化二亞胺從復合物上脫落。反應中加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)作為催化劑，可以加速反應的進行。反應完后梯度透析得到石房蛤毒素人工抗原。制備步驟如下：

(1)將石房蛤毒素(STX)溶于二甲基亞砜(DMSO)中配制成0.1μg/μL的STX母液；將水溶性碳化二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和卵清白蛋白(OVA)用0.01M磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.5)分別配制成1mg/mL的工作液；

(2)取100μL?STX母液，加入20μL?EDC工作液和12μL?NHS工作液，STX、EDC、NHS反應的摩爾比為1∶2-3∶1-2，室溫震蕩反應3h，獲得最初反應液；

(3)載體蛋白選擇卵清白蛋白(OVA)和牛血清白蛋白(BSA)，OVA作為免疫抗原載體，BSA作為包被抗原載體，用0.01M磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.5)將兩種載體蛋白配成1mg/mL的工作液。

(4)STX和載體蛋白反應的最佳摩爾比為10∶1；將(2)步驟中的反應物加入到100μL的載體蛋白工作液中，4℃震蕩反應12h，獲得最終反應液；