[發(fā)明專利]石房蛤毒素人工抗原和抗體及其制備方法和應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110054584.7
• 申請日: 2011-03-08
• 公開（公告）號: CN102206270A
• 公開（公告）日: 2011-10-05
• 發(fā)明（設計）人: 周德慶;劉帥帥;趙峰;朱蘭蘭;柳淑芳
• 申請（專利權）人: 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所
• 主分類號: C07K14/77
• 分類號: C07K14/77;C07K16/18;C07K16/06;G01N33/543
• 代理公司: 青島海昊知識產(chǎn)權事務所有限公司 37201
• 代理人: 張中南

1.一種石房蛤毒素人工抗原，為石房蛤毒素人工抗原STX-OVA，其結構式為：

2.如權利要求1所述的石房蛤毒素人工抗原的制備方法，其特征在于是將石房蛤毒素上的氨基與卵清白蛋白OVA上的羧基相連得到石房蛤毒素人工抗原，包括以下步驟：

(1)將石房蛤毒素STX溶于二甲基亞砜DMSO中，配成0.1μg/μL的STX母液；將水溶性碳化二亞胺EDC和N-羥基琥珀酰亞胺NHS用0.01M?pH7.5磷酸鹽緩沖液PBS，分別配制成1mg/mL相應工作液；

(2)取100μL?STX母液，加入20μL?EDC工作液和12μL?NHS工作液，室溫震蕩反應3h制成最初反應液；

(3)用0.01M?pH7.5的PBS緩沖液將卵清白蛋白配成1mg/mL的卵清白蛋白工作液；

(4)將步驟(2)中的最初反應液加入到100μL卵清白蛋白工作液中，震蕩反應12h獲得最終反應液；

(5)將上述的最終反應液轉(zhuǎn)移到透析卡中，用300mL?0.01M?pH7.5的PBS緩沖液和DMSO的混合液透析72h，每12h換液1次，透析完后取出反應物即制得石房蛤毒素人工抗原。

3.如權利要求2所述的石房蛤毒素人工抗原的制備方法，其特征在于STX∶EDC∶NHS反應的摩爾比為1∶3∶2。

4.如權利要求2所述的石房蛤毒素人工抗原的制備方法，其特征在于上述的透析是采用梯度透析法，第一次透析的溶液中PBS緩沖液和DMSO的體積比為100∶4-5，第二次透析的體積比為100∶3-4，第三次透析的體積比為100∶2-3，第四次透析的體積比為100∶1-2，第五次透析的體積比為100∶0.5-1，以后透析的溶液不加DMSO。

5.權利要求1所述的石房蛤毒素人工抗原用于制備石房蛤毒素抗體。

6.如權利要求5所述的石房蛤毒素抗體，其特征在于是用石房蛤毒素人工抗原STX-OVA作為免疫抗原免疫小鼠，分離純化血清得到的石房蛤毒素多克隆抗體。

7.權利要求6所述的石房蛤毒素抗體的制備步驟如下：用STX-OVA免疫6周齡的雌性BALB/c小鼠，首次免疫用200μL?STX-OVA與等體積弗氏完全佐劑，充分乳化后制成乳濁液，腹腔注射小鼠，之后每隔兩周取同量STX-OVA與等體積弗氏不完全佐劑充分乳化，腹腔注射；免疫三次后取尾血測定小鼠血清效價，若效價不高，繼續(xù)免疫；待效價大于要求值后取血，室溫放置30min，8000r/min離心20min，取上層血清，用蛋白A抗體離心純化試劑盒純化血清，得到石房蛤毒素多克隆抗體。

8.權利要求6所述的石房蛤毒素多克隆抗體應用于制備石房蛤毒素的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。

9.如權利要求8所述的檢測石房蛤毒素的ELISA試劑盒，其特征在于：所述試劑盒依間接競爭ELISA原理研制而成，包括：

a、ELISA板條：每個試劑盒含4塊真空包裝的ELISA板，每塊板含包被抗原包被的可拆卸的ELISA微孔板條，規(guī)格為8孔×12條；

b、洗滌液PBS-T：10倍濃縮的pH為7.4的含0.1％體積分數(shù)的吐溫20的PBS溶液200mL；

c、純化的石房蛤毒素多克隆抗體血清5mL；

d、辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG酶標二抗1mL；

e、底物顯色液50mL：配制方法為取50μL?TMB溶液+10mL底物緩沖液十10μL?30％過氧化氫，混勻；底物緩沖液的配制為稱取檸檬酸19.2g加水至1000mL，為甲液；稱取磷酸氫二鈉71.7g，加水至1000m?L，為乙液；取甲液24.3mL，乙液25.7mL，加水至100mL即為底物緩沖液；

f、終止液：2M硫酸溶液10mL；

g、石房蛤毒素標準抗原液1mL，濃度為9.65μM/L；

h、稀釋液：0.01M?pH為7.5的PBS溶液500mL。