[發(fā)明專利]制備利用人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞治療缺血性腦損傷注射液的方法及其注射液

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110054458.1
• 申請日: 2011-03-07
• 公開（公告）號: CN102119936A
• 公開（公告）日: 2011-07-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李榮旗;郭麗麗;劉佳新
• 申請（專利權(quán)）人: 李榮旗;郭麗麗;劉佳新
• 主分類號: A61K35/48
• 分類號: A61K35/48;A61K9/08;C12N5/0735;A61P9/10
• 代理公司: 北京雙收知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11241
• 代理人: 盧新

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及了一種治療缺血性腦損傷注射液的方法及其注射液，特別是制備利用人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞治療缺血性腦損傷注射液的方法及其注射液。

背景技術(shù)

干細(xì)胞(Stem?cell，SC)是一類具有自我更新(self-renewing)和多向分化潛能的細(xì)胞，在一定的條件下，可以分化成多種功能的細(xì)胞或組織器官，醫(yī)學(xué)界稱之為“萬用細(xì)胞”。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal?stem?cells，MSCs)是SC中的一類，它來源于發(fā)育早期中胚層，廣泛存在于骨髓、骨膜、脂肪、羊水、真皮、牙、骨骼肌、胎肺、胎肝、臍血、臍帶等多種組織中，同樣具有自我更新，高度增殖和多向分化潛能。目前人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞(MSCs)已成為干細(xì)胞研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于各系統(tǒng)疾病的治療研究。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的神經(jīng)修復(fù)與再生一直是神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域的重點(diǎn)和難點(diǎn)。這是因?yàn)橹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)缺乏其它系統(tǒng)的器官組織強(qiáng)大的自我修復(fù)能力，絕大多數(shù)神經(jīng)元受損后不能再生，再生的細(xì)胞也不能建立正常的樹突和軸突聯(lián)系，從而造成不同程度的神經(jīng)功能障礙，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的各種調(diào)節(jié)功能。近年來，隨著醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展和干細(xì)胞研究的不斷深入，基因治療、移植免疫學(xué)和發(fā)育生物學(xué)等學(xué)科間相互滲透與促進(jìn)，干細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)損傷中的修復(fù)作用越來越備受關(guān)注。

由于羊膜是來源于胎兒的產(chǎn)物，暴露于母體免疫系統(tǒng)監(jiān)視下，其表面人類白細(xì)胞抗原(HLA)--A、B、C低表達(dá)，不表達(dá)HLA-DR，提示羊膜移植不引發(fā)免疫排斥。間充質(zhì)干細(xì)胞是低免疫原性細(xì)胞，不引發(fā)異常淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，并且能通過抑制T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞功能，影響樹突狀細(xì)胞活性，此外還可以產(chǎn)生各種生長因子、細(xì)胞因子、趨化因子和蛋白酶來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和改變組織微環(huán)境，刺激內(nèi)源性干細(xì)胞減輕免疫炎癥反應(yīng)。人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞低表達(dá)MHC-I，不表達(dá)MHC-II，可以避免免疫排斥反應(yīng)，SUSANNE等對同一條件下人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞、人羊膜上皮細(xì)胞與脂肪組織來源的干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)活性進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)羊膜來源的間充質(zhì)干細(xì)胞和上皮干細(xì)胞免疫抑制作用的發(fā)揮依賴于?細(xì)胞接觸和細(xì)胞劑量。

血管內(nèi)皮細(xì)胞是組織工程化血管的核心，是血管外科和心臟外科血管移植物的主要材料。目前研究利用各種間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化取得了很大進(jìn)展。Joachim等采用密度梯度法分離人MSCs，加入2％胎牛血清和50μg/L血管內(nèi)皮生長因子(vascula?r?endothelialgrowth?factor，VEGF)誘導(dǎo)7d，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)前后細(xì)胞沒有明顯的形態(tài)學(xué)改變，但免疫組織化學(xué)提示VIII因子抗體有顯著的升高，電鏡可以發(fā)現(xiàn)Weibel-Palade小體(W-P小體)。同時(shí)，細(xì)胞表達(dá)CD44、CD73、CD90、CD105、CD166、VFGF受體KDR/Flt21、血管內(nèi)皮黏附分子及血管細(xì)胞黏附分子。在半固體培養(yǎng)基中還可以形成血管腔樣結(jié)構(gòu)。誘導(dǎo)后的細(xì)胞呈梭形，傳代超過5代后細(xì)胞即變寬、變平，故有關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞的研究應(yīng)在第1～5代之間進(jìn)行。Liang等應(yīng)用VEGF和堿性成纖維生長因子誘導(dǎo)后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞形成血管腔樣結(jié)構(gòu)，周圍有呈鋪路石樣排列的內(nèi)皮樣細(xì)胞。兔抗VEGF受體1(Flt21)最早陽性表達(dá)，隨后CD34、CD31、Flt21、VIII因子抗體也陽性表達(dá)并呈逐漸增加的趨勢。Gang等則提取臍血MSCs經(jīng)VEGF、表皮生長因子和皮質(zhì)醇激素誘導(dǎo)3周，同樣誘導(dǎo)出具有內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)記的細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)有一些細(xì)胞因子分泌。