[發明專利]制備利用人羊膜間充質細胞治療缺血性腦損傷注射液的方法及其注射液

有效

• 申請號: 201110054458.1
• 申請日: 2011-03-07
• 公開（公告）號: CN102119936A
• 公開（公告）日: 2011-07-13
• 發明（設計）人: 李榮旗;郭麗麗;劉佳新
• 申請（專利權）人: 李榮旗;郭麗麗;劉佳新
• 主分類號: A61K35/48
• 分類號: A61K35/48;A61K9/08;C12N5/0735;A61P9/10
• 代理公司: 北京雙收知識產權代理有限公司 11241
• 代理人: 盧新

1.一種制備利用人羊膜間充質細胞治療缺血性腦損傷注射液的方法及其注射液，其特征在于：它包括以下步驟：

(1)將人羊膜組織分離成單個人羊膜間充質細胞；

(2)將人羊膜間充質細胞擴增2-3代到所需的數目后，加入DMEM/F12得到含有人羊膜間充質細胞的懸濁液，使人羊膜間充質細胞的個數為1×10⁶個/毫升-2×10⁶個/毫升；

(3)將上述人羊膜間充質細胞在-196℃至-185℃的液氮下冷凍保存；

(4)在需要配制注射液之前，將上述的冷凍人羊膜間充質細胞復蘇；

(5)將人羊膜間充質細胞擴增3-5代到所需的數目后，加入DMEM/F12得到含有人羊膜間充質細胞的懸濁液，使人羊膜間充質細胞的個數為1×10⁷個/毫升-2×10⁷個/毫升；

(6)將上述人羊膜間充質細胞放入生理鹽水中，每毫升生理鹽水中含有10⁵個至10⁶個活的人羊膜間充質細胞。

2.如權利要求1所述的一種制備利用人羊膜間充質細胞治療缺血性腦損傷注射液的方法及其注射液，其特征在于：所述的步驟(3)包括：將在培養瓶底部融合85％以上的人羊膜間充細胞，用D-hank’s過洗2次，然后加入2毫升0.25％胰蛋白酶，待細胞60-70％縮小變圓之后，加2毫升含有蛋白酶抑制劑的終止液，回收細胞懸液，在室溫下將其放入離心機中以1500r/min的轉速離心5分鐘，將上述溶液中的上清液倒掉；然后加入含有10％-20％白蛋白+40％DMSO+50％DMEM/F12的冷凍液，制成細胞懸液，加入凍存管中，在凍存管上做好標記，包括細胞類型、代數、冷凍日期和細胞數，將凍存管放入-85℃的冰箱內放置3至4小時后，再將凍存管直接投入液氮中保存。

3.如權利要求2所述的一種制備利用人羊膜間充質細胞治療缺血性腦損傷注射液的方法，其特征在于：所述的步驟(4)包括：將裝有人羊膜間充質細胞的凍存管從液氮中取出，用鑷子夾住凍存管上部在室溫25℃中空氣浴5秒鐘；然后將凍存管投入水浴溫度為37℃的水浴鍋，輕輕晃動凍存管使得管壁受熱均勻，隨時觀察人羊膜間充質細胞解凍情況，在40-85秒鐘后，待冷凍液全部融化后將凍存管取出，將人羊膜間充質細胞懸液吸至10毫升DMEM/F12中，離心洗滌，在室溫下將其放入離心機中以1500r/min的轉速離心5分鐘，將上述溶液中的上清液倒掉，重復上述離心洗滌兩次。

4.如權利要求3所述的一種制備利用人羊膜間充質細胞治療缺血性腦損傷注射液的方法及其注射液，其特征在于：步驟(2)和步驟(5)包括以下步驟：是分別將步驟(1)和步驟(4)得到人羊膜間充質細胞和無血清培養液放置在培養瓶中，培養瓶在溫度為36.5-37.5℃、飽和濕度、體積分數為4.5％的CO₂培養箱中培養，每2-3天更換全部培養液，培養5-7天，觀察培養瓶中人羊膜間充質細胞融合達到85％以上時，去掉培養液，用D-hank’s液清洗兩遍后，再加2毫升0.25％的胰蛋白酶消化液進行消化，在消化過程中，用顯微鏡下觀察細胞的消化情況，當60-70％的細胞變化成圓形時，立即加入2毫升含有蛋白酶抑制劑的終止液終止消化，然后吹打培養瓶的壁，將貼壁的細胞吹打下來；將回收的間充質細胞放入離心機內以1500r/min轉速每次離心5分鐘，共計兩次，然后倒掉上清液，并計算細胞的個數；重復上述操作進行傳代接種培養，直至達到所需細胞數量。

5.如權利要求4所述的一種制備利用人羊膜間充質細胞治療缺血性腦損傷注射液的方法，其特征在于：所述步驟(6)是人羊膜間充質細胞放入生理鹽水中，在搖動頻率為30-60轉/分鐘的搖床上搖勻。

6.一種利用人羊膜間充質細胞治療缺血性腦損傷的注射液，其特征在于：所述的注射液包括：每毫升生理鹽水中含有10⁴個至10⁶個活的人羊膜間充質細胞。

7.如權利要求6的一種利用人羊膜間充質細胞治療缺血性腦損傷的注射液，其特征在于：所述的注射液為靜脈注射液，它被配制成100毫升的注射液，即在100毫升生理鹽水中含有10⁶個至10⁷個活的人羊膜間充質細胞。