[發明專利]多糖-蛋白軛合物疫苗

有效

• 申請號: 201110053968.7
• 申請日: 2004-08-06
• 公開（公告）號: CN102151331A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發明（設計）人: 車恒·羅伯特·李;卡爾·E·弗拉施
• 申請（專利權）人: 美國政府健康及人類服務部
• 主分類號: A61K39/02
• 分類號: A61K39/02;A61K39/09;A61K39/095;A61K39/102;A61K39/112;A61K39/385;A61K47/48;A61P31/04
• 代理公司: 北京英賽嘉華知識產權代理有限責任公司 11204
• 代理人: 王達佐;洪欣

發明領域

本發明提供了以較高產量合成與制備多糖-蛋白軛合物疫苗的方法。該方法涉及在一種反應物上的酰肼基與另一種反應物上的醛基或氰酸鹽酯基反應。所述反應以較高的軛合效率快速進行。可使用簡化的純化方法從未軛合的蛋白和多糖以及其他小分子副產物中分離所述軛合產物。

發明背景

細菌多糖(PSs)是在大齡兒童和成人中誘導短期免疫的非T細胞依賴性抗原，但幼小嬰兒卻常常缺乏。PSs并不能與主要組織相容性復合物結合，所述主要組織相容性復合物是抗原提呈以及刺激T-輔助淋巴細胞所必需的。PSs可以在無需T-輔助細胞淋巴細胞的幫助下刺激B淋巴細胞產生抗體。作為所述B淋巴細胞非T細胞依賴性刺激的結果，在這些抗原的免疫之后依然缺少記憶誘導。

通過多糖與蛋白分子的共價結合，非T細胞依賴性多糖抗原可轉變為T細胞依賴性抗原。結合于所述軛合物疫苗多糖部分的B細胞可由輔助性T細胞來活化，該輔助性T細胞對該軛合載體蛋白部分的多肽具有特異性。對該載體蛋白產生應答的T輔助細胞能增強針對該多糖的抗體產生。多糖軛合疫苗是由蛋白與多糖的共價連接形成的多糖-蛋白雜合體。因為大多數天然細菌多糖在先經受某些化學修飾(“活化”)之前不能與蛋白化學相連，所以通常需要在結合前對所述多糖進行化學修飾。

對所述蛋白的結合產生了多種T細胞抗原決定簇。這些T細胞抗原決定簇會與CD4輔助性T細胞相互作用，極大地促進對所述結合多糖的抗體應答。甚至在嬰兒體內，對軛合物的所述T輔助細胞依賴性應答可產生血清IgG抗體和免疫記憶。而且，與天然多糖相比，所述?多糖軛合物的免疫原性對所述軛合多糖的大小的依賴程度有所降低。因此，采用多糖或寡糖制備的軛合物具有類似的免疫原性。

可采用多種軛合反應將多糖與蛋白共價連接。三種較為常用的方法有：1)還原性氨基化，其中一種反應成分的醛基或酮基與另一種反應成分的氨基或酰肼基反應，所形成的C＝N雙鍵隨后被還原劑還原成C-N單鍵；2)氰基化軛合，其中可通過溴化氰(CNBr)或1-氰-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸(CDAP)向該羥基引入一個氰基，在加入蛋白成分后，其與氨基或酰肼基形成共價鍵；3)碳二亞胺反應，其中碳二亞胺能活化所述軛合反應中一種成份的羧基，所活化的羧基再與另一成分的氨基或酰肼基反應。這些反應經常被用來在所述軛合反應之前對所述軛合物的成份進行活化。

b型嗜血流感桿菌(Hib)軛合物疫苗是用于臨床的第一種多糖-蛋白軛合物疫苗。Robbins及其同事在1980年運用生物工程技術將糖化學地連接到蛋白載體上，這是50年前就發展出來的概念。參見Avery等人，J.Exp.Med.1929；50：533-550；Schneerson等人，J.Exp.Med?1980；152：361-376。在美國目前有四種不同的Hib軛合物疫苗獲得了許可，每種各不相同，且各自具有其物理，化學和免疫學特征，如表1所總結。在這些疫苗所使用的軛合化學和質量控制的詳細論述已經出版。參見Ellis等人在《b型等嗜血桿菌軛合物疫苗的發展與臨床應用》(Development?and?clinical?uses?of?Haemophilus?b?conjugate?vaccines)一書中由Kniskern等人所著的《軛合物：設計，化學與分析》″Conjugation：design，chemistry，and?analysis″章節，紐約，Marcel?Dekker出版社，1994年，37-69頁。

表1

^*所述四種Hib軛合物疫苗通常以其縮寫以及括號中對應的生產廠商來進行描述。

最先商業化的Hib軛合物，多聚核糖基核糖醇磷酸白喉類毒素軛合物(PRP-D)通過6-碳間隔物、己二酸二酰肼(ADH)連接于白喉類毒素的部分大小減少的Hib多糖，使用的是Schneerson等人的方法，J.Exp.Med.1980；152：361-376。在1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)存在的條件下，使用ADH以該方法進行反應得到了白喉類毒素的ADH衍生物。然后通過使用CNBr在所述羥基上產生氰基來活化所述His多糖。將所活化的多糖與所述ADH-類毒素(氰基化軛合)軛合，但該方法產生的連接不穩定，而且所述軛合物還具有溶解性的問題。