[發明專利]rDNA ITS-D3區核苷酸序列在建立藥用植物DNA條形碼鑒別系統中的應用

有效

• 申請號: 201110053038.1
• 申請日: 2011-03-04
• 公開（公告）號: CN102191318A
• 公開（公告）日: 2011-09-21
• 發明（設計）人: 陳蔚文;段中崗;詹若挺;楊錦芬;何瑞;徐暉
• 申請（專利權）人: 廣州中醫藥大學;惠州學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/10;G06F19/24
• 代理公司: 廣州市天河廬陽專利事務所 44244
• 代理人: 胡濟元

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及包含核酸的檢測和應用方法，具體涉及利用核苷酸序列鑒別藥用植物的方法。

背景技術

藥用植物是中藥材的原植物，是一些具有保健和藥用價值的植物物種。據統計，我國有11146種藥用植物(占全部中藥資源的87％)，分屬383科，2309屬。對這一萬多種藥用植物進行快速、準確鑒定是擺在我國中醫藥工作者面前的一項緊迫而艱巨的任務。藥用植物現有的鑒別方法主要根據形態特征來鑒別，通過采集待鑒定樣品各器官(如花、果實、種子、根、莖、葉)或組織的形態特征，查閱藥用植物文獻資料、圖片及標本，對照比較后得出鑒定結果。這一方法易受植物生長發育階段、環境條件及鑒定人員的經驗影響，鑒定效率較低，而且對一些形態相似的藥用植物容易判斷錯誤。

隨著現代分子生物學特別是DNA測序技術的迅速發展，國際上開始發展DNA條形碼技術(DNA?barcoding)來鑒別物種。DNA條形碼技術是以物種細胞中的一段短的標準的DNA區域作為條形碼標記，對生物物種進行準確、快速、自動鑒定的技術。該技術直接分析植物的基因型而非表現型，鑒別結果不受環境因素、樣品形態和材料來源的影響，可以確保藥材的基原真實。

目前國際上已采用CBOL植物條形碼工作組(CBOL?Plant?Working?Group.，A?DNA?barcodefor?land?plants.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2009，106：12794-12797.)提出的以質體基因matK+rbcL組成的雙位點植物DNA條形碼方案。使用時，用戶采用通用引物PCR擴增matK和rbcL兩個位點并測序，將獲得的matK和rbcL序列提交到生物條形碼數據庫BOLD(http://www.boldsystems.org)進行查詢，即可獲得樣品的生物分類信息。但是這一標準方案在鑒別植物物種時尚存在以下缺點：1.需要測試matK和rbcL兩個位點，工作量大，成本較高；2.rbcL雖然有通用引物，但序列在物種中進化速率較慢，而matK雖然序列進化速率較快，但缺乏通用引物，這些缺點使matK+rbcL只能區別約70％的植物物種，鑒別能力不理想。

植物核糖體DNA(rDNA)通常呈18S-5.8S-26S順反子排列于染色體上，在基因組中高度重復(幾百至幾千次)。位于18S與5.8S之間的內轉錄間隔區1(ITS1)以及位于5.8S與?26S之間的內轉錄間隔區2(ITS2)因具有較高的序列變異速率，已被廣泛用于植物系統發生、遺傳多樣性等研究(Alvarez，I.，Wendel，J.F.，2003.Ribosomal?ITS?sequences?and?plant?phylogenetic?inference.Mol.Phylogenet.Evol.29：417-434.)。最近，一些學者認為ITS2適合作為植物DNA條形碼位點，用來區別不同植物物種(Shilin?Chen，Hui?Yao，Jianping?Han，Chang?Liu，Jingyuan?Song，Linchun?Shi，Yingjie?Zhu，Xinye?Ma，Ting?Gao，Xiaohui?Pang，Kun?Luo，Ying?Li，Xiaocheng?Jia，Yulin?Lin，Christine?Leon.Validation?of?the?ITS2Region?as?a?Novel?DNA?Barcode?for?Identifying?Medicinal?Plant?Species.PLOSONE.2010，15(1)：e8613)。但是單獨采用ITS2作為植物DNA條形碼存在以下缺點：1.ITS2序列在許多物種中存在多個不同的拷貝，需對PCR產物進行克隆并挑取多個陽性克隆測序；2.由于缺少保守區，ITS2序列在分類廣泛的物種中難以準確比對。