[發明專利]一種新的氧肟酸類嗜鐵素的制備方法

無效

• 申請號: 201110052619.3
• 申請日: 2011-03-03
• 公開（公告）號: CN102181499A
• 公開（公告）日: 2011-09-14
• 發明（設計）人: 梁建根;陶榮祥;施躍峰;郝中娜;王連平;陳建忠;陳識峰;竺利紅;吳吉安
• 申請（專利權）人: 浙江省農業科學院
• 主分類號: C12P13/02
• 分類號: C12P13/02;A01N37/26;A01P3/00;C12R1/40
• 代理公司: 杭州賽科專利代理事務所 33230
• 代理人: 陳輝

技術領域

本發明涉及一種新的嗜鐵素，具體涉及一種氧肟酸類嗜鐵素的制備方法及其在黃瓜枯萎病中的應用。

背景技術

利用有益菌進行病蟲害防治，已是目前研究的一個熱點問題，至今已有多種菌株成功地被開發成產品并得到推廣。它們在病蟲害防治中的重要地位來自他們固有的一些屬性。假單胞桿菌(Peudomonas?spp.)是一類得到廣泛研究的生防細菌，這類細菌能產生特殊物質嗜鐵素，而分泌嗜鐵素是其控制真菌病害的一種主要機制，因而成為科研工作者研究的熱點對象。嗜鐵素是一類小分子量(500～1000Da)能特異地螯合Fe³⁺的螯合因子，絕大多數細菌和真菌都能通過非核糖途徑合成分泌一種或幾種嗜鐵素，它的產生是地球上微生物適應地殼高氧低鐵環境的結果。嗜鐵素按照它的螯合基團的化學特性可分為三大類：一類為氧肟酸類(hydroxamate)嗜鐵素、一類為兒茶酚類(catechol)嗜鐵素、還有一類為混合型(mixed?ligand)嗜鐵素，有的報道稱其為α-羥基羧酸(α-hydroxycarboxylic)(也稱作檸檬酸型)。關于嗜鐵素的研究，國內外目前仍處于基礎性研究階段。其提純和結構分析方面的研究起步較早，而國內卻鮮見報道，迄今為止，人們已經發現500多種化學結構不同的嗜鐵素。目前，國內外對嗜鐵素的研究主要集中在其所參與的生防活動。例如，許煜泉(1999)對生防菌Peudomonas?sp.JKD-2在低鐵條件下抑制稻瘟菌的生長的研究驗證了嗜鐵素鐵競爭這一抗病性功能。陳雙雅(2003)和陳旋(2006)研究中提到嗜鐵素的抗生作用，即嗜鐵素直接通過抑制病原菌來起到控制病害目的。Marla?Guineth(2000)也提到嗜鐵素的抗生作用。冉隆賢(2005)通過對嗜鐵素缺失突變體控制桉樹灰霉病的研究提到了嗜鐵素對病害的誘導抗性作用。Van?peer?R(1992)，Leeman?M(1996)和V.Ramamoorthy(2000)也提到嗜鐵素的誘導作用。此外，嗜鐵素近年來還探索應用于醫藥等領域^[18]。總之，嗜鐵素的功能是多樣的，它不但是依賴受體的高親和性的鐵轉運系統，還是生長因子或萌發因子，也可以是抗生素或毒力因子。由此可見，嗜鐵素是一種很有開發和利用價值的新型生物活性物質。

發明內容

本發明的目的是從惡臭假單胞菌HZ-2菌株(Pseudomonas?putida)(菌株HZ-2，是本發明人于2008年3月分離自浙江省杭州市多年種植蔬菜的杭州下沙喬司監獄旁的大棚，經鑒定屬于惡臭假單胞菌)中分離出新的具有實用價值嗜鐵素和該化合物的制備方法，及其在防治植物病害，特別是防治黃瓜枯萎病中的應用。惡臭假單胞菌的從不同地地域采的菌株也可以得到此類新物質。

一方面，本發明提供一種異羥肟酸類型嗜鐵素，具有如下結構：

本發明的異羥肟酸類型嗜鐵素從植物促生細菌惡臭假單胞菌HZ-2菌株(Pseudomonas?putida)中分離得到的，其結構式由通式表示(如下圖)：

另一方面，本發明還提供一種新氧肟酸類型嗜鐵素的制備方法，包括以下的步驟：

(1)、發酵液體的準備：菌種惡臭假單胞菌HZ-2在固體KMB培養基上活化24h后，挑取單菌落接入5mL液體KMB培養基中，置于搖床中，28℃，150r/分鐘條件下培養24h，然后接種到固體種子培養基KMB中，在28℃下培養24h，得到一級種子；然后將培養好的一級種子挑取一環，在MKB培養基中發酵，其中以上所有用到固體或液體KMB培養基在1000毫升體積下成分包括：酪蛋白氨基酸5g，MgSO₄·7H₂O?2.5g，K₂HPO₄·3H₂O?2.5g，Fe³⁺的含量為0.1mg/L。

(2)、收集步驟(1)中發酵液1000mL旋轉蒸發(43℃)濃縮成稍粘稠液體，離心去除白色不溶物，上清液用HCl將pH調至4備用；

(3)、把步驟(2)中得到的上清液樣品上到大孔吸附樹脂柱后液體濃縮后用CAS檢測液檢查，不顯示活性，再用不同極性的洗脫液依次洗脫，對洗脫液進行減壓濃縮后，測定活性，其中不同極性的依次洗脫的洗脫液為：離子水、0.2％鹽酸溶液、10％甲醇-水溶液、30％甲醇-水溶液、50％甲醇-水溶液、80％甲醇-水溶液、100％甲醇、100％丙酮溶液洗脫。

優選的，將步驟(3)洗脫的樣品用HPLC分離，分離的條件為：材料ODS-BP；流速：1ml/分鐘；流動相：30％甲醇-水溶液洗脫30分鐘。