[發(fā)明專利]一種高芽孢率的枯草芽孢桿菌發(fā)酵方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110051406.9
• 申請日: 2011-03-03
• 公開（公告）號: CN102168055A
• 公開（公告）日: 2011-08-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 崔京春;張寶君;張獻(xiàn);吳俊罡;郭海勇
• 申請（專利權(quán)）人: 大連吉翔農(nóng)業(yè)科技有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/125
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責(zé)任公司 21212
• 代理人: 畢進(jìn)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種枯草芽孢桿菌的發(fā)酵方法，具體是涉及一種高芽孢率的枯草芽孢桿菌發(fā)酵方法，屬于微生物發(fā)酵工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)

枯草芽孢桿菌是應(yīng)用最廣泛的產(chǎn)酶微生物之一，其廣泛分布在土壤及腐敗的有機(jī)物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。枯草芽孢桿菌菌體生長過程中產(chǎn)生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短桿菌肽等活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)對致病菌或內(nèi)源性感染的條件致病菌有明顯的抑制作用。枯草芽孢桿菌能迅速消耗環(huán)境中的游離氧，造成腸道低氧，促進(jìn)有益厭氧菌生長，并產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸類，降低腸道PH值，間接抑制其它致病菌生長。刺激動物免疫器官的生長發(fā)育，激活T、B淋巴細(xì)胞，提高免疫球蛋白和抗體水平，增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫功能，提高群體免疫力。枯草芽孢桿菌菌體自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等酶類，在消化道中與動物體內(nèi)的消化酶類一同發(fā)揮作用。能合成維生素B1、B2、B6、煙酸等多種B族維生素，提高動物體內(nèi)干擾素和巨噬細(xì)胞的活性。所以，枯草芽孢桿菌廣泛用于動物的保健與疾病預(yù)防和治療領(lǐng)域。

目前國內(nèi)眾多枯草芽孢桿菌生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)過程中普遍存在菌數(shù)偏低特別是芽孢率偏低的問題，一般芽孢含量在2.0×10⁹CFU/ml以下，大大影響了產(chǎn)品的成本以及質(zhì)量。為此，采取措施提高枯草芽孢桿菌的芽孢率是十分必要的。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有微生物發(fā)酵技術(shù)的不足造成枯草芽孢桿菌發(fā)酵芽孢率不高的問題，提供了一種高芽孢率的枯草芽孢桿菌發(fā)酵方法，以提高產(chǎn)品的芽孢含量和質(zhì)量穩(wěn)定。

本發(fā)明所述原料枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)來源為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(AS1.15)。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：一種高芽孢率的枯草芽孢桿菌發(fā)酵方法，包括以下步驟：

①將枯草芽孢桿菌無菌劃線接種于無菌固體培養(yǎng)基上，35～38℃靜止培養(yǎng)5～7天，得到激活的枯草芽孢桿菌；

所述固體培養(yǎng)基按質(zhì)量百分比，是由如下組分組成：牛肉膏0.20～0.50％、氯化鈉0.30～0.80％、蛋白胨0.80～1.20％、瓊脂1.50～2.00％，余量為水，pH?7.0～7.5；

②將激活的枯草芽孢桿菌接種于30L的種子發(fā)酵罐的無菌培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基裝量為20L，發(fā)酵條件為：溫度35～38℃，罐壓0.02～0.06Mpa，通氣比例：起始通氣比為1∶0.5，當(dāng)溶氧值低于20時加大通氣比為1∶1，當(dāng)溶氧值回升高于70時降低通氣比；攪拌轉(zhuǎn)數(shù)：起始為150rpm，根據(jù)溶氧值調(diào)整(溶氧值升高，降低攪拌轉(zhuǎn)數(shù)；溶氧值降低，升高攪拌轉(zhuǎn)數(shù))最大攪拌不超過200rpm，發(fā)酵培養(yǎng)8～14小時，得到種子菌液；

所述種子發(fā)酵罐中培養(yǎng)基按質(zhì)量百分比，是由如下組分組成：蔗糖0.20～0.70％、尿素0.10～0.40％、磷酸氫二鉀0.40～0.80％、磷酸二氫鉀0.20～0.40％、酵母膏0.02～0.06％、氯化鐵0.01～0.04％、碳酸鈣0.01～0.04％、硫酸鎂0.05～0.20％、硫酸錳0.01～0.04％、淀粉0.30～0.80％、豆粕1.00～1.50％、黃豆0.80～1.20％(泡發(fā)后粉碎)、泡敵0.01～0.02％，余量為水，pH?6.0～7.0；

③將種子菌液接種于2000L發(fā)酵罐的滅菌培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基裝量為1400L，發(fā)酵條件與步驟②相同，發(fā)酵培養(yǎng)20～26小時，收集發(fā)酵培養(yǎng)液得到高芽孢率枯草芽孢桿菌液體產(chǎn)品；

步驟③所述培養(yǎng)基的組分與步驟②培養(yǎng)基的組分相同；

培養(yǎng)基的滅菌條件為：121℃、0.11Mpa滅菌20～30min。

結(jié)晶紫染色后油鏡觀察，芽孢率90％以上。

本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)在于：培養(yǎng)基成分易得且價格便宜、工藝參數(shù)簡單、發(fā)酵周期短，所得的枯草芽孢桿菌活菌數(shù)高，并且芽孢率高，可以達(dá)到3.0×10⁹CFU/ml以上，顯著提高產(chǎn)品的芽孢數(shù)和產(chǎn)品質(zhì)量。

具體實(shí)施方式

為了更好理解本發(fā)明，以下用實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1

①將-70℃保存于甘油中的枯草芽孢桿菌無菌劃線接種于滅菌固體培養(yǎng)基上(培養(yǎng)基按質(zhì)量百分比，由如下組分組成：牛肉膏0.30％、氯化鈉0.50％、蛋白胨1.00％、瓊脂2.00％，余量為水，pH?7.2，121℃、0.11Mpa滅菌20min)，37℃靜止培養(yǎng)6天。