[發(fā)明專利]副豬嗜血桿菌實時熒光定量PCR檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110048711.2
• 申請日: 2011-03-01
• 公開（公告）號: CN102174653A
• 公開（公告）日: 2011-09-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李軍;陳澤祥;楊威;謝宇舟;彭昊;禤雄標(biāo);謝永平;許力干;胡帥;馬春霞;潘艷
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12R1/21
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務(wù)所有限責(zé)任公司 45104
• 代理人: 翁建華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及熒光定量PCR檢測，尤其是一種副豬嗜血桿菌實時熒光定量PCR檢測方法。

背景技術(shù)

副豬嗜血桿菌(Haemophilus?parasuis，HPS)屬于巴氏德菌科嗜血桿菌屬。HPS通常定植在豬上呼吸道，正常條件下不引起豬發(fā)病，但是當(dāng)機體處于應(yīng)激狀態(tài)或免疫功能下降時可以突破上呼吸道的防御機制，侵入機體多個器官，引起多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎，嚴(yán)重者導(dǎo)致體溫升高、呼吸困難甚至死亡，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。

目前對HPS的診斷主要是細(xì)菌分離培養(yǎng)和常規(guī)PCR方法。HPS的培養(yǎng)條件要求高，需要NAD、馬血清和5％CO₂環(huán)境，培養(yǎng)時間需24～48h，在分離培養(yǎng)過程中常常出現(xiàn)雜菌污染。普遍使用的Oliverira等建立的PCR方法(OLIVEIRA?S，GALINA?L，PIJOAN?C.Development?of?a?PCR?test?to?diagnose?Haemophilus?parasuis?infections[J].J?Vet?Diagn?Invest，2001，13：1495-1501)雖然可以直接對病料進行檢測，但檢測費時且不能準(zhǔn)確定量和存在假陽性的可能。

實時熒光PCR是一種對DNA數(shù)量進行檢測分析的PCR技術(shù)，具有操作簡便、敏感性和特異性強、重復(fù)性好等優(yōu)點，而且結(jié)果具有實時性，更準(zhǔn)確直觀，已廣泛應(yīng)用于基因的表達(dá)檢測和定量研究中。于江等人指出16SrRNA基因序列不宜用作熒光定量PCR檢測，并建立了以infB基因作為靶基因的HPS熒光定量PCR檢測技術(shù)(于江，吳家強等.副豬嗜血桿菌熒光定量PCR檢測技術(shù)的建立與應(yīng)用.家畜生態(tài)學(xué)報.2010，31(4)：77-81)。但是，該研究僅限于HPS血清5型，對其它血清型的通用性未作有效驗證，而且其方法只能區(qū)分副豬嗜血桿菌和鏈球菌及巴氏桿菌，抗相關(guān)菌干擾能力有限。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種快速、靈敏、準(zhǔn)確、通用性好、抗干擾能力強的副豬嗜血桿菌實時熒光定量PCR檢測方法。

為解決上述技術(shù)問題本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：副豬嗜血桿菌實時熒光定量PCR檢測方法，即通過熒光染料嵌合PCR反應(yīng)中所發(fā)出的熒光信號進行檢測，以登錄號AB004028的副豬嗜血桿菌的16S?rRNA基因序列為參考，其引物序列和擴增序列分別為：

引物序列1?5’-GAC?GGG?AAA?CTG?TCG?CTA-3’

引物序列2?5’-CTA?GAG?ATC?GTC?GGC?TTG-3’

擴增序列為序列表SEQ.ID.No.3的堿基序列。

上述方法包括如下步驟：

<1>制備DNA樣本：取待檢樣本進行總DNA的提取純化；

<2>實時熒光定量PCR反應(yīng)：取步驟<1>所得DNA樣本作為模板進行熒光PCR擴增，并同時分別以標(biāo)準(zhǔn)品DNA和去離子水為陽性對照樣本和陰性對照樣本進行熒光PCR擴增；

<3>建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：取已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品DNA按10倍稀釋法稀釋成5×10⁷～5×10⁰拷貝/μL?8個濃度梯度，按步驟<2>的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進行擴增，反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)得到的各濃度梯度的循環(huán)閾值Ct繪制熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線；

將DNA樣本的循環(huán)閾值Ct與標(biāo)準(zhǔn)曲線對照，得到待檢DNA樣本中的16S?rRNA基因片段拷貝濃度，據(jù)此得到樣本中的副豬嗜血桿菌的細(xì)菌數(shù)量。

熒光定量PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系、擴增程序和測定擴增片段的熔解程序分別為：

反應(yīng)體系：PCR混合液20μL，其中SYBR?GreenI?Mix?9μL、5pmol/μL的上下游引物各0.3μL、DNA模板2.5μL以及去離子水7.9μL；

擴增程序：95℃5min，隨后進行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃20s，62℃20s，68℃20s；

測定擴增片段的熔解程序：按每0.5℃/10s的升溫速率從55℃升至95℃進行熔解曲線分析驗證。