[發(fā)明專利]副豬嗜血桿菌實時熒光定量PCR檢測方法無效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201110048711.2 | 申請日： | 2011-03-01 |
| 公開（公告）號： | CN102174653A | 公開（公告）日： | 2011-09-07 |
| 發(fā)明（設計）人： | 李軍;陳澤祥;楊威;謝宇舟;彭昊;禤雄標;謝永平;許力干;胡帥;馬春霞;潘艷 | 申請（專利權(quán)）人： | 廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所 |
| 主分類號： | C12Q1/68 | 分類號： | C12Q1/68;C12R1/21 |
| 代理公司： | 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司 45104 | 代理人： | 翁建華 |
| 地址： | 530001 廣西*** | 國省代碼： | 廣西;45 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 嗜血 桿菌 實時 熒光 定量 pcr 檢測 方法 | ||
1.一種副豬嗜血桿菌實時熒光定量PCR檢測方法，通過熒光染料嵌合PCR反應中所發(fā)出的熒光信號進行檢測，其特征在于以登錄號AB004028的副豬嗜血桿菌的16S?rRNA基因序列為參考，其引物序列和擴增序列分別為：
引物序列1?5’-GAC?GGG?AAA?CTG?TCG?CTA-3’
引物序列2?5’-CTA?GAG?ATC?GTC?GGC?TTG-3’
擴增序列為序列表SEQ.ID.No.3的堿基序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的副豬嗜血桿菌實時熒光定量PCR檢測方法，其特征在于所述方法包括如下步驟：
<1>制備DNA樣本：取待檢樣本進行總DNA的提取純化；
<2>實時熒光定量PCR反應：取步驟<1>所得DNA樣本作為模板進行熒光PCR擴增，并同時分別以標準品DNA和去離子水為陽性對照樣本和陰性對照樣本進行熒光PCR擴增；
<3>建立標準曲線：取已知濃度的標準品DNA按10倍稀釋法稀釋成5×107～5×100拷貝/μL?8個濃度梯度，按步驟<2>的PCR反應體系和反應程序進行擴增，反應結(jié)束后，根據(jù)得到的各濃度梯度的循環(huán)閾值Ct繪制熒光定量PCR標準曲線；
將DNA樣本的循環(huán)閾值Ct與標準曲線對照，得到待檢DNA樣本中的16S?rRNA基因片段拷貝濃度，據(jù)此得到樣本中的副豬嗜血桿菌的細菌數(shù)量。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的副豬嗜血桿菌實時熒光定量PCR檢測方法，其特征在于所述熒光定量PCR反應的反應體系、擴增程序和測定擴增片段的熔解程序分別為：
反應體系：PCR混合液20μL，其中SYBR?Green?I?Mix?9μL、5pmol/μL的上下游引物各0.3μL、DNA模板2.5μL以及去離子水7.9μL；
擴增程序：95℃5min，隨后進行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃20s，62℃20s，68℃20s：
測定擴增片段的熔解程序：按每0.5℃/10s的升溫速率從55℃升至95℃進行熔解曲線分析驗證。
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