[發(fā)明專利]一種4-1BBL蛋白的制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110045245.2
• 申請日: 2011-02-24
• 公開（公告）號: CN102174522A
• 公開（公告）日: 2011-09-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黃茵
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州師范大學(xué)
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/81;C07K14/47
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種4-1BBL蛋白的制備方法。

(二)背景技術(shù)

4-1BB/4-1BBL是CD28/B7之外的另一對重要的協(xié)同刺激信號分子。4-1BB(CD137)屬腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族，主要分布在活化的T細胞、NK細胞和DC細胞等表面，其配體4-1BBL(CD137L)主要表達在專職APC細胞(如單核巨噬細胞、DC細胞、B細胞)、活化的T細胞及一些腫瘤細胞上。4-1BBL是II型跨膜糖蛋白，分子量為34KD，人和小鼠有36％的同源性。

4-1BB/4-1BBL信號對增強和維持免疫應(yīng)答有重要作用。與CD28/B7信號傳導(dǎo)通路比較，4-1BB/4-1BBL主要在免疫應(yīng)答的后期，為CD8⁺T細胞克隆擴增、存活和記憶性殺傷提供信號，其刺激T細胞增殖和分泌細胞因子的作用在缺乏強大的CD28/B7信號時表現(xiàn)更明顯。4-1BB的激活對CD4⁺和CD8⁺T細胞均有作用，但優(yōu)先刺激CD8⁺T細胞的活化。除了通過4-1BB受體刺激T細胞外，4-1BBL也通過其反向信號傳導(dǎo)通路刺激單核細胞，導(dǎo)致M-CSF表達及釋放多種細胞因子，延長單核細胞存活期，促進細胞增殖和有絲分裂。

近年，4-1BB/4-1BBL信號傳導(dǎo)通路已成為腫瘤免疫治療設(shè)計的一個新靶點。體內(nèi)實驗表明，4-1BB單抗能預(yù)防活化誘導(dǎo)的細胞死亡(AICD)，促進荷瘤宿主中淋巴細胞的增殖，并選擇性促進I型細胞因子分泌，增強效應(yīng)細胞的抗腫瘤作用。這種抗腫瘤作用對腫瘤的再次攻擊有記憶性，證實有長期的抗腫瘤免疫反應(yīng)存在。此外，轉(zhuǎn)染4-1BBL的腫瘤細胞接種小鼠后無腫瘤生長，并存在抵御腫瘤再次攻擊的免疫力。研究還發(fā)現(xiàn)，融合蛋白Ig-4-1BBL與抗-4-1BB抗體一樣能有效誘導(dǎo)腫瘤持續(xù)的特異性CTLs，治療小鼠肝結(jié)腸癌。

另一方面，在治療性疫苗的研究中證實，表達4-1BBL的重組痘病毒明顯增強HIV疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生以IFN-γ應(yīng)答為特征的特異性CD8⁺T細胞應(yīng)答，這種作用在免疫后2個月仍能檢測到。在CEA-轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，4-1BBL重組痘病毒明顯增強表達B7.1和CEA的重組痘病毒疫苗的治療作用，該作用與CEA特異性CD4⁺和CD8⁺T細胞應(yīng)答水平增高相關(guān)。最近有報道，以包括4-1BBL在內(nèi)的幾種共刺激分子作為DNA疫苗的分子佐劑能誘導(dǎo)強大的細胞應(yīng)答和回憶反應(yīng)。以上結(jié)果均展示了4-1BBL在人類腫瘤和感染性疾病免疫治療中的應(yīng)用前景。

現(xiàn)有技術(shù)對4-1BBL蛋白的制備方法是直接從組織細胞提取，得率低、成本高。不能大量應(yīng)用于體內(nèi)試驗或臨床。

(三)發(fā)明內(nèi)容

為了提高4-1BBL蛋白的得率，降低成本，為制備臨床前試驗用藥或診斷試劑提供大量的原材料，本發(fā)明提供了一種采用4-1BBL(TNFSF9，NP_033430.1)胞外段蛋白的cDNA以基因工程方法制備含206個氨基酸殘基(Arg?104-Glu?309)的重組4-1BBL蛋白的方法。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種4-1BBL蛋白的制備方法，所述方法包括：

(1)取含4-1BBL蛋白的小鼠淋巴細胞，conA體外刺激培養(yǎng)后經(jīng)trizol裂解，抽提得到mRNA；所用原料為常規(guī)含4-1BBL蛋白的小鼠淋巴細胞；

(2)將mRNA逆轉(zhuǎn)錄得到4-1BBL胞外段蛋白的cDNA；

(3)對步驟(2)所得cDNA進行PCR擴增，得到4-1BBL蛋白目的基因；PCR擴增引物為：上游引物：5’-CTC?GAG?AAA?AGA?AGAACC?GAG?CCA?AGA?CCT-3’，下游引物：5’-GAA?TTC?TTC?CCATGG?ATT?ATC?AGG-3’；

(4)將步驟(3)PCR產(chǎn)物用Xho?I和EcoR?I雙酶切后定向插入經(jīng)同樣雙酶切的ppic9，獲得重組質(zhì)粒ppic9-4-1BBL；

(5)將重組質(zhì)粒ppic9-4-1BBL轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，經(jīng)培養(yǎng)擴增、抽提純化、測序分析，獲得測序正確的重組質(zhì)粒；

(6)將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至甲醇酵母菌，誘導(dǎo)表達重組蛋白；

(7)將表達重組蛋白的活化菌株進行誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵液離心，取上清液分離純化，得到純化的4-1BBL重組蛋白。