[發(fā)明專利]一種4-1BBL蛋白的制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110045245.2
• 申請日: 2011-02-24
• 公開（公告）號: CN102174522A
• 公開（公告）日: 2011-09-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黃茵
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州師范大學(xué)
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/81;C07K14/47
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

1.一種4-1BBL蛋白的制備方法，所述方法包括：

(1)取含4-1BBL蛋白的小鼠淋巴細(xì)胞，conA體外刺激培養(yǎng)后經(jīng)trizol裂解，抽提得到mRNA；

(2)將mRNA逆轉(zhuǎn)錄得到4-1BBL胞外段蛋白的cDNA；

(3)對步驟(2)所得cDNA進(jìn)行PCR擴增，得到4-1BBL蛋白目的基因；PCR擴增引物為：上游引物：5’-CTC?GAG?AAA?AGA?AGAACC?GAG?CCAAGA?CCT-3’，下游引物：5’-GAA?TTC?TTC?CCATGG?ATT?ATC?AGG-3’；

(4)將步驟(3)PCR產(chǎn)物用Xho?I和EcoR?I雙酶切后定向插入經(jīng)同樣雙酶切的ppic9，獲得重組質(zhì)粒ppic9-4-1BBL；

(5)將重組質(zhì)粒ppic9-4-1BBL轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，經(jīng)培養(yǎng)擴增、抽提純化、測序分析，獲得測序正確的重組質(zhì)粒；

(6)將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至甲醇酵母菌，誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白；

(7)將表達(dá)重組蛋白的活化菌株進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵液離心，取上清液分離純化，得到純化的4-1BBL重組蛋白。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(5)重組質(zhì)粒ppic9-4-1BBL序列如下：CTC?GAG?AAA?AGA?AGA?ACC?GAG?CCA?AGA?CCT?GCATTG?ACC?ATT?ACT?ACT?TCT?CCA?AAC?TTG?GGT?ACA?AGA?GAAAAC?AAC?GCT?GAC?CAG?GTC?ACT?CCA?GTT?TCT?CAC?ATC?GGATGT?CCA?AAC?ACC?ACC?CAG?CAG?GGA?TCT?CCT?GTT?TTT?GCTAAG?TTG?TTG?GCC?AAA?AAC?CAG?GCT?TCT?TTG?TGT?AAC?ACTACC?TTG?AAC?TGG?CAC?TCT?CAA?GAC?GGT?GCC?GGT?TCT?TCTTAC?TTG?TCT?CAG?GGT?TTG?AGA?TAC?GAG?GAG?GAC?AAG?AAGGAG?TTG?GTC?GTC?GAC?TCT?CCT?GGA?TTG?TAC?TAC?GTC?TTTTTG?GAG?TTG?AAG?TTG?TCT?CCA?ACA?TTC?ACC?AAC?ACT?GGACAC?AAG?GTT?CAG?GGA?TGG?GTT?TCT?TTG?GTT?TTG?CAG?GCTAAG?CCA?CAG?GTT?GAC?GAT?TTC?GAC?AAT?TTG?GCC?TTG?ACTGTC?GAA?TTG?TTC?CCT?TGC?TCT?ATG?GAA?AAC?AAA?TTG?GTCGAC?AGA?TCT?TGG?TCT?CAA?TTG?TTG?TTG?TTG?AAG?GCC?GGACAC?AGA?TTG?TCT?GTC?GGA?TTG?AGA?GCA?TAC?TTG?CAT?GGTGCA?CAA?GAC?GCT?TAC?AGA?GAC?TGG?GAG?TTG?TCT?TAC?CCTAAC?ACC?ACT?TCT?TTC?GGT?TTG?TTC?TTG?GTT?AAA?CCT?GAT?AATCCATGG?GAA?GAA?TTC。