[發明專利]一種重組雞β干擾素的制備方法及其應用

有效

• 申請號: 201110044022.4
• 申請日: 2011-02-24
• 公開（公告）號: CN102154307A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發明（設計）人: 沈萍萍;蔡梅紅
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: C12N15/22
• 分類號: C12N15/22;C12N15/70;C07K14/565;C07K1/22;A61K38/21;A61P31/12
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 胡錫瑜

技術領域

本發明屬于分子免疫學技術領域，具體涉及一種體外高效制備雞β干擾素的方法及其應用。

背景技術

β干擾素是一種重要的I型干擾素，主要是由成纖維細胞和白細胞在病毒核酸、多聚肌苷酸多聚胞苷酸(?Poly?IC)等干擾素誘生物質刺激下所分泌的一種糖蛋白。β干擾素不僅在抗病毒固有免疫過程中發揮著重要作用，而且具有抗腫瘤、抗增殖和免疫調節等功能。在一些α干擾素使用失敗的病例（多發性硬化癥）或效果欠佳的病例（嚴重急性呼吸綜合癥,SARS）中，β干擾素能夠發揮非常好的效果。

從β干擾素的科研價值和臨床應用的價值來推測，雞β干擾素在雞相關疾病的防制和科研研究中必將會起一定的作用。但是要使雞β干擾素在獸醫臨床上和基礎研究中得到應用，必須先獲得在體外大量生產雞β干擾素的能力。

目前，在國內，雞干擾素相關的研究中，雞β干擾素的研究還很少，現有的研究有：內蒙古農業大學的關平原教授實驗室的銀曉博士對雞β干擾素的基因進行了克隆，并采用pGEX-2T載體對其進行了融合表達。但是雞β干擾素是一種生物活性物質，融合表達的雞β干擾素其生物活性會受到很大影響。另外，南京農業大學陳偉業博士在CHO細胞中表達了雞β干擾素基因。一般來說，用真核細胞表達的外源蛋白具有生物活性好的優點，但是也存在表達量少的缺點，且研究表明利用真核細胞宿主系統達到雞β干擾素產業化生產，需要企業有嚴格的細胞培養條件和培養環境，并需要付出昂貴的細胞培養成本，不利于工業化生產。

發明內容

（一）本發明要解決的技術問題是：提供一種可用于工業化生產，生產成本低，生產效率高，可用于動物醫學基礎研究和臨床應用的雞β干擾素的體外制備方法，以彌補目前國內商品化雞β干擾素的空白。

（二）本發明的技術方案是：

1?雞β干擾素成熟蛋白基因的克?。?/b>

從國內雞場購買三黃雞，取雞肝的全基因組。以GenBank上公布的雞β干擾素的基因序列為原始模板，利用分子生物學軟件Primer?Primer?5.0設計一對引物，用于擴增出雞β干擾素成熟蛋白基因。

2?含有雞β干擾素成熟蛋白基因原核表達載體的構建與鑒定

利用PCR的方法擴增的雞β干擾素成熟蛋白基因的前后兩端的酶切位點，把雞β干擾素成熟蛋白基因與同樣用上述兩種限制性內切酶酶切的PET28a表達載體相連，連接產物在大腸桿菌中增殖后，轉化菌培養后重新提取的質粒經酶切后電泳，能獲得大小為531bp條帶的質?？梢澡b定為已連接上雞β干擾素成熟蛋白基因的重組載體(PET28a-chIFNβ)。

4?含雞β干擾素成熟蛋白基因重組載體是否能在大腸桿菌中表達的鑒定

把PET28a載體和PET28a-chIFNβ重組載體分別轉化BL-21宿主菌，在IPTG加入后進行誘導，并通過SDS-PAGE來鑒定雞β干擾素成熟蛋白基因是否能在大腸桿菌中進行高效表達。

5?大腸桿菌表達的雞β干擾素包涵體的制備、變性、純化與復性工藝的探索

??對大腸桿菌表達的雞β干擾素的包涵體用一些去污劑洗滌處理初步純化后，再用高濃度變性劑的處理，使其溶解在尿素中，然后利用大腸桿菌表達的雞β干擾素末端6個組氨酸的標簽，通過NI-NTA層析柱進行親和層析純化，使其濃度進一步提高，達到作為標準品和商品化生產的要求。在此工程中，確定具體的操作條件和溶液

6大腸桿菌表達的雞β干擾素生物活性的測定

采用國際上通用的微量病變抑制法來測定在大腸桿菌中高效表達后處理之后，是否具有抗病毒的生物學活性。

本發明中采用的是本實驗室從當地三黃雞中克隆的雞β干擾素成熟蛋白的基因序列如下：

tgcaaccatcttcgtcaccaggatgccaacttctcttggaaaagcctccagctccttcagaatacggctccacctccacc

acagccttgcccacaacaagacgtgacttttccatttccagaaacccttctgaagagcaaggacaagaagcaagcagcca

tcaccaccctccgcatcctccaacacctcttcaacatgcttagcagcccacacactccaaaacactggattgaccgcaca