[發(fā)明專利]一種重組雞β干擾素的制備方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110044022.4
• 申請日: 2011-02-24
• 公開（公告）號: CN102154307A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 沈萍萍;蔡梅紅
• 申請（專利權(quán)）人: 南京大學(xué)
• 主分類號: C12N15/22
• 分類號: C12N15/22;C12N15/70;C07K14/565;C07K1/22;A61K38/21;A61P31/12
• 代理公司: 南京知識律師事務(wù)所 32207
• 代理人: 胡錫瑜

1.一種重組雞β干擾素的生產(chǎn)方法，其特征是由以下步驟構(gòu)成：

?重組載體PET28a-chIFNβ的構(gòu)建

根據(jù)genbank上公布的序列，設(shè)計一對引物，通過PCR的方法擴(kuò)增出雞β干擾素成熟蛋白基因；把雞β干擾素成熟蛋白基因的PCR產(chǎn)物酶切后與同樣兩種限制性內(nèi)切酶酶切的PET28a表達(dá)載體相連，連接產(chǎn)物在大腸桿菌中增殖后，轉(zhuǎn)化菌培養(yǎng)后重新提取的質(zhì)粒經(jīng)EcoR?I和Sal?I酶切；酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定發(fā)現(xiàn)，531bp大小的雞β干擾素成熟蛋白基因核酸條帶清晰可見，說明重組PET28a-chIFNβ載體已經(jīng)構(gòu)建成功，重組載體轉(zhuǎn)化BL-21菌后，通過IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；

大腸桿菌表達(dá)的雞β干擾素包涵體的制備、變性、純化與復(fù)性工藝

將1000ml誘導(dǎo)表達(dá)菌經(jīng)8000rpm/min×10min離心后收集的菌體用pH=7.2的PBS洗滌一次，洗滌后離心的菌體用40ml的50mM的Tris-HClPH8.0,?含1mM的EDTA懸起，-20℃作用過夜；次日以450W功率的超聲波裂解25min3S,3S后，4℃，2000g/min×10min離心后取上清，再8000rpm離心20min后取沉淀，即得重組雞β干擾素包涵體；包涵體用含1%?TritonX-100的50mM的Tris-HClPH8.0,?含1mM的EDTA溶液洗滌后，再用含2M尿素的50mM的Tris-HClPH8.0,?含1mM的EDTA溶液洗滌，洗滌后的沉淀用含1mM?EDTA和10mM的DTT的8M的50mM的NaH₂PO₄(PH8.0),0.3M的NaCl，50mM的咪唑溶液4℃攪拌溶解12h；

溶解后的重組雞β干擾素包涵體變性液上清經(jīng)0.22um的濾膜處理后，用含NI-NTA層析介質(zhì)的親和層析柱對其進(jìn)行親和純化；NI-NTA層析介質(zhì)裝柱后用10個柱體積的親和層析的平衡液進(jìn)行平衡，流速控制在每分鐘1ml；平衡后在層析介質(zhì)上輕輕鋪上經(jīng)過洗滌純化的重組雞β干擾素包涵體變性液，然后加入20個柱體積的親和層析漂洗液進(jìn)行漂洗，去除非特異性吸附的雜蛋白，最后用5個柱體積的洗脫液進(jìn)行洗脫；收集洗脫峰放入截留分子量為3KD的透析帶，以含5M尿素的PBS溶液進(jìn)行透析，每8h換一次透析液，共透析16h；繼而分別以含3M,1M尿素的PBS溶液進(jìn)行透析，同樣是每8h換一次透析液，不同尿素濃度的透析液各透析16h，最后以PBS溶液透析24h，每8h換一次透析液；透析復(fù)性結(jié)束后的雞β干擾素溶液用0.22um的濾膜后，測定蛋白濃度為0.26mg/ml,-20℃保存?zhèn)溆茫H和層析的平衡液為含8M尿素的50mM的NaH₂PO₄PH8.0,0.3M的NaCl，50mM的咪唑溶液，漂洗液為含8M尿素的50mM的NaH₂PO₄PH8.0,0.3M的NaCl，100mM的咪唑溶液.洗脫液為含8M尿素的50mM的NaH2PO₄(PH8.0),0.3M的NaCl，500mM的咪唑溶液。

2.權(quán)利要求1中所述的重組雞β干擾素的生產(chǎn)方法所構(gòu)建的重組表達(dá)載體PET28a-chIFNβ。

3.權(quán)利要求2中所述的重組雞β干擾素的生產(chǎn)方法所構(gòu)建的重組表達(dá)載體PET28a-chIFNβ的制備方法，其特征是由以下步驟構(gòu)成：

①雞β干擾素成熟蛋白基因的克隆，

②含雞β干擾素成熟蛋白基因重組載體的構(gòu)建與鑒定，

③含雞β干擾素成熟蛋白基因重組載體在大腸桿菌中的高效表達(dá)。

4.權(quán)利要求1中所述的重組雞β干擾素的生產(chǎn)方法生產(chǎn)的雞β干擾素在雞病毒性疾病藥物中的應(yīng)用。

5.權(quán)利要求1中所述的重組雞β干擾素的生產(chǎn)方法生產(chǎn)的雞β干擾素在制備動物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究標(biāo)準(zhǔn)品中的應(yīng)用。