[發(fā)明專利]日本蟳Jassr129微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110043717.0
• 申請日: 2011-02-19
• 公開（公告）號: CN102162010A
• 公開（公告）日: 2011-08-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉萍;李健;宋春妮
• 申請（專利權(quán)）人: 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 青島聯(lián)智專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 37101
• 代理人: 楊秉利

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于日本蟳微衛(wèi)星DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)，具體說是一種日本蟳Jassr129微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的檢測方法。

背景技術(shù)

本發(fā)明做出之前，國內(nèi)外在其他蟹類中有相關(guān)的研究報(bào)道，Pamela?C.Jensen等在對鄧杰內(nèi)斯蟹(Cancer?magister)的研究中，設(shè)計(jì)了99個微衛(wèi)星引物，并對其中的9個進(jìn)行了合成。利用尼龍膜雜交法，Masatsugu?takhano等在鋸緣青蟹(正蟳，Scylla?serrata)中發(fā)現(xiàn)5個具有可變性的微衛(wèi)星位點(diǎn)。David?Gopurenko等在鋸緣青蟹(沙蟳，Scylla?paramamosain)的研究中篩選到5個微衛(wèi)星位點(diǎn)。利用常規(guī)方法，E.S?Yap等在遠(yuǎn)海梭子蟹(Portunus?pelagicus)中篩選到7個含有二核苷酸重復(fù)單元、1個含有四核苷酸重復(fù)單元的微衛(wèi)星位點(diǎn)。H.S.AN等利用PCR篩選法，在中華絨螯蟹(Eriocheir?sinensis)基因組富集文庫中篩選出9個新的微衛(wèi)星位點(diǎn)。B.等在中華絨螯蟹中篩選到12個具有高度多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)。國內(nèi)的宋來鵬、李曉萍等從基因組文庫和微衛(wèi)星富集文庫中篩選了30多個多態(tài)性的微衛(wèi)星標(biāo)記，并進(jìn)行了標(biāo)記多態(tài)信息含量做出了評價；劉磊等應(yīng)用這些標(biāo)記進(jìn)行了家系鑒定的系譜認(rèn)證分析；羅云等將這些標(biāo)記應(yīng)用到日本蟳遺傳圖譜構(gòu)建中。至今為止，尚未見有關(guān)日本蟳微衛(wèi)星DNA檢測技術(shù)方面的報(bào)道。

微衛(wèi)星(microsatellites)或稱簡單序列重復(fù)(simple?sequence?repeats，SSR)是指由1～6個核苷酸組成的簡單串聯(lián)重復(fù)DNA序列。迄今研究過的所有生物種類中都發(fā)現(xiàn)了它的存在，并且分布密度很大。由于微衛(wèi)星廣泛分布于基因組中，具有密度大、多態(tài)性豐富、高度雜合且穩(wěn)定性好、遵循孟德爾分離定律共顯性遺傳、易于PCR擴(kuò)增等特點(diǎn)，已成為近年來最引人注目的新型DNA標(biāo)記，并廣泛應(yīng)用于生物資源的家系譜系認(rèn)證、基因連鎖分析、遺傳圖譜構(gòu)建、種質(zhì)鑒定、種群遺傳多樣性等許多研究領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明是針對目前尚未有對日本蟳微衛(wèi)星DNA檢測技術(shù)公開的現(xiàn)狀，提出一種日本蟳Jassr129微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的檢測方法，可快捷的獲得日本蟳的Jassr129遺傳標(biāo)記基因座位呈現(xiàn)高度遺傳變異的多態(tài)性圖譜，方法簡便，所得結(jié)果可直觀地檢測出日本蟳在此位點(diǎn)的每個個體的基因型。

本發(fā)明檢測技術(shù)主要利用磁珠富集法建立的日本蟳微衛(wèi)星富集文庫中Jassr129的微衛(wèi)星DNA序列，使用Primer(Version?5.00)軟件在其核心序列的兩端設(shè)計(jì)相應(yīng)的PCR引物，將引物序列合成后對日本蟳個體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而快速地檢測日本蟳每個個體在此微衛(wèi)星區(qū)的遺傳變異，從而獲得該引物對日本蟳在Jassr129序列區(qū)的遺傳變異圖譜，通過該圖譜直觀地表現(xiàn)出每個個體的基因型。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種日本蟳Jassr129微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的檢測方法，其特征在于，操作程序?yàn)椋菏紫忍崛∪毡鞠y基因組DNA并稀釋備用；再利用日本蟳基因組文庫中的Jassr129微衛(wèi)星核心序列，在其序列兩端設(shè)計(jì)特異性引物；然后使用該引物對日本蟳不同地理群或群內(nèi)個體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠檢測；利用產(chǎn)物出現(xiàn)的條帶進(jìn)行分析，確定每個個體的基因型，從而獲得日本蟳在Jassr129核心序列區(qū)高度遺傳變異的多態(tài)性圖譜；Jassr129微衛(wèi)星核心序列的特異性引物序列分別為：正鏈5’-CATTACGCTCGGAAAGTG-3’，負(fù)鏈3’-TTCAGCAGCACAACCTCT-5’，使用該引物時的退火溫度為49℃。

對上述技術(shù)方案的改進(jìn)：提取日本蟳基因組DNA，將其稀釋為50ng/μL，每個PCR反應(yīng)中加入3μL，反應(yīng)總體積為20μL。

對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)：所述PCR擴(kuò)增的加樣參數(shù)為：每個PCR反應(yīng)總體積為20μL，包括50ng日本蟳基因組DNA3μL；含15mmol/L?Mg²⁺的10X?PCRBuffer2.0μL；2.5mmol/L?dNTP?1.6μL；5U/μL的Taq0.2μL；本發(fā)明的引物10mmol/L各1μL；最后加ddH₂O至20μL；使用該引物時設(shè)置PCR儀的程序參數(shù)為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性45s，49℃退火45s，72℃延伸45s，35個循環(huán)；最后72℃再延伸10min；4℃保存。