[發明專利]副溶血性弧菌雙重實時熒光PCR檢測引物、探針、檢測試劑盒和檢測方法

有效

• 申請號: 201110043486.3
• 申請日: 2011-02-22
• 公開（公告）號: CN102146469A
• 公開（公告）日: 2011-08-10
• 發明（設計）人: 許龍巖;袁慕云;易敏英;凌莉;陽靜;張旺;鄒志飛;相大鵬
• 申請（專利權）人: 廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 余炳和

技術領域：

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及重要的食源性病原菌副溶血性弧菌(Vibrio?Parahemolyticus)的雙重實時熒光PCR檢測引物、探針、檢測試劑盒和檢測方法，適合于進出口食品檢驗、疾病控制中心、質量監督部門使用。

背景技術：

副溶血弧菌(VibrioParahaemolyticus)是一種革蘭氏陰性嗜鹽桿菌，是沿海國家的重要食物中毒致病菌之一，可導致患者腹瀉、腸痙攣、惡心、嘔吐、發燒等典型胃腸炎反應。副溶血性弧菌主要存在于海水及海產品中，在日本由該菌引起的食物中毒占細菌性食物中毒的40％～60％，位居首位。另外，美國、澳大利亞、英國、比利時、法國、韓國和東南亞地區，都有該菌引起食物中毒爆發的報告。我國從1998年以來的資料顯示，副溶血弧菌引發的食物中毒的發生規模及人群暴露規模呈明顯上升趨勢，均已超過沙門氏菌食物中毒，躍居細菌性中毒的首位。

副溶血性弧菌傳統的檢測方法是基于形態特征、染色特征、生化特征、血清分型等表型特征來鑒定。這些常規的方法在副溶血性弧菌研究工作中起到了重要作用，但現代科學技術的發展，傳統的依靠表型特征來鑒定副溶血性弧菌的方法，已遠遠不能滿足對該菌的快速診斷以及流行病學研究的需要，暴露出許多不足之處：操作繁瑣，鑒定周期長，不利于急性中毒的快速診斷和口岸快速通關的要求；副溶血性弧菌的致病機理復雜且多樣化，不含毒力因子的菌株不一定致病，而傳統的培養鑒定法短時間內無法確定該菌的毒力強弱，還需繼續增加其他特殊的生化等鑒定實驗，這無疑使鑒定周期更加漫長。因此，迫切急需研究出能夠更加快速、準確無誤、檢測通量更高、人為影響因素盡可能減少，而且能獲得分離的病原體基因型別、毒力基因分布等多重信息的檢測方法。

用于副溶血性弧菌分子檢測比較常見的主要有常規PCR、單一實時熒光PCR以及基因芯片等。雖然，常規PCR具有高靈敏度、操作簡單等優點，但是需要對產物進行后處理，容易污染，同時，染色劑、紫外光等對操作人員身體健康有威脅，不易自動化和標準化；基因芯片技術具有高特異性、高通量等優點，但是需要先擴增再雜交，技術還不是很穩定，尤其是儀器設備昂貴，不利于推廣應用。實時熒光PCR技術充分結合了PCR擴增和探針雜交的優勢，具有高靈敏度、高特異性，重復性和穩定性良好的優點，一次上機即可完成結果檢測，容易自動化。

實時熒光PCR技術根據熒光能量傳遞原理，融合了PCR技術的高效擴增、探針技術的高特異性、光譜技術的高敏感性和高精確性等優點。它是利用熒光信號伴隨著PCR產物的增加而增強的原理，在PCR擴增過程中，連續不斷地檢測反應體系中熒光光信號的變化。根據熒光信號基線的平均值和平均標準差，在99.7％的置信度時計算出大于平均值的熒光信號即閾值，然后收集熒光信號增強到預定閾值時的PCR循環次數(即Ct值)。該參數和PCR反應體系中起始DNA模板量的對數值之間有嚴格的線性關系。利用陽性梯度稀釋標準品的Ct值繪制成標準曲線，再根據檢測樣品的Ct值就可以準確地測定靶標病原菌的起始模板拷貝數。

實時熒光定量PCR的化學原理包括探針類和非探針類兩種，探針類是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴增產物的增加，非探針類則是利用熒光染料或者特殊設計的引物來指示擴增的增加。前者由于增加了探針的識別步驟，特異性更高，但后者則簡便易行。

目前副溶血性弧菌的熒光PCR檢測上，文獻報道以gyrase為目的基因就無法區分副溶血性弧菌和溶藻弧菌，tlh和tdh為靶基因容易出現假陽性結果。副溶血性弧菌在我妻氏瓊脂上引起β-溶血，稱為神奈川現(KP現象)。KP現象是鑒定副溶血性弧菌致病性和非致病性菌株的一項重要指標，其主要是熱穩定性溶血素tdh基因引起，tdh基因是副溶血性弧菌的主要毒力因子，具有致死毒性、心臟毒性、細胞毒性和腸毒素作用。最近的研究還表明，tdh基因家族也廣泛存在于人類致病性弧菌中，如部分霍利斯弧菌(V.hollisae)，某些擬態弧菌菌株中也有tdh基因，非O1群霍亂弧菌中也存在同源性約為93％～96％的tdh相關基因。因此，以單獨以tdh基因為目標基因就無法準確鑒定出副溶血性弧菌。

在單一熒光PCR基礎上的多重實時熒光PCR方法，可針對多個基團為目的基因進行檢測。多重實時熒光PCR法用于病原菌的檢測，無論在國內還是在國外都剛剛起步，目前尚無副溶血性弧菌的多重實時熒光PCR的檢測試劑盒問世。

發明內容：