[發明專利]副溶血性弧菌雙重實時熒光PCR檢測引物、探針、檢測試劑盒和檢測方法

有效

• 申請號: 201110043486.3
• 申請日: 2011-02-22
• 公開（公告）號: CN102146469A
• 公開（公告）日: 2011-08-10
• 發明（設計）人: 許龍巖;袁慕云;易敏英;凌莉;陽靜;張旺;鄒志飛;相大鵬
• 申請（專利權）人: 廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 余炳和

1.一種副溶血性弧菌(Vibrio?Parahaemolyticus)雙重實時熒光PCR檢測引物，其特征在于，所述的檢測引物如下所示：

針對toxR基因：5`-AGCAGTACGCAAATCGGTAG-3`；

5`-CAATCGTTGAACCAGAAGCG-3`；

針對tdh基因：5`-GGCTGACATCCTACATGACTG-3`；

5`-AGAATGACCGTGCTTATAGCC-3`。

2.一種副溶血性弧菌雙重實時熒光PCR檢測探針，其特征在于，所述的檢測探針如下所示：

toxR基因的探針：5`-AGGATTCACAGCAGAAGCCACAGG-3`；

tdh基因的探針：5`-CAGACACCGCTGCCATTGTATAGTCTT-3`；

探針的5`端標記有熒光報告基團，3`端標記有熒光淬滅基團，兩探針的5`端標記的熒光報告基團是不同的熒光報告基團。

3.根據權利要求2所述的副溶血性弧菌雙重實時熒光PCR檢測探針，其特征在于，所述的熒光報告基團為FAM、HEX或VIC，所述的熒光淬滅基團為BHQ1。

4.一種副溶血性弧菌雙重實時熒光PCR檢測試劑盒，包括實時熒光定量PCR反應液、耐熱DNA聚合酶、檢測引物和檢測探針，其特征在于，

所述的檢測引物包括兩對：

(1)針對toxR基因：5`-AGCAGTACGCAAATCGGTAG-3`；

5`-CAATCGTTGAACCAGAAGCG-3`；

(2)針對tdh基因：5`-GGCTGACATCCTACATGACTG-3`；

5`-AGAATGACCGTGCTTATAGCC-3`；

所述的檢測探針包括：

(1)toxR基因的探針：5`-AGGATTCACAGCAGAAGCCACAGG-3`；

(2)tdh基因的探針：5`-CAGACACCGCTGCCATTGTATAGTCTT-3`；

探針的5`端標記有熒光報告基團，3`端標記有熒光淬滅基團，兩探針的5`端標記的熒光報告基團是不同的熒光報告基團。

5.一種副溶血性弧菌雙重實時熒光PCR檢測方法，用于檢測食品或海產品，其特征在于，包括以下步驟：

(1)對樣品進行增菌培養，提取增菌液中菌體的基因組DNA作為模板；

(2)使用權利要求1所述的針對toxR基因和tdh基因的檢測引物和權利要求2所述的toxR基因和tdh基因的檢測探針，與實時熒光PCR擴增用的反應液及耐熱DNA聚合酶混合形成擴增反應體系；

(3)將擴增反應體系在熒光PCR儀上進行實時熒光PCR反應，反應結束后，根據探針標記的熒光報告基團記錄的熒光信號，讀取并記錄各檢測樣品的PCR擴增循環次數(Ct)；

(4)根據各樣品的Ct值，按照建立的判斷標準，判斷樣品中是否含有副溶血性弧菌，以及該副溶血性弧菌是否含有毒力基因tdh基因。