[發明專利]復制缺陷甲病毒表達載體系統及疫苗制備方法

無效

• 申請號: 201110043401.1
• 申請日: 2011-02-23
• 公開（公告）號: CN102443603A
• 公開（公告）日: 2012-05-09
• 發明（設計）人: 彭濤;劉鈿蓮;王弋
• 申請（專利權）人: 廣東華南聯合疫苗開發院有限公司
• 主分類號: C12N15/86
• 分類號: C12N15/86;A61K39/00;A61K39/125;A61K39/13;A61P31/14
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 李柏林

技術領域

本發明涉及一種甲病毒表達載體系統及使用該表達系統制備疫苗的方法，特別涉及一種復制缺陷甲病毒表達載體系統的重組甲病毒大規模培養，并利用這一表達系統制備疫苗的方法。

背景技術

披膜病毒科中的甲病毒的核酸序列主要由兩部分構成，結構蛋白和非結構蛋白序列組成。帶有非結構蛋白序列復制子可以RNA的復制，并能大量擴增結構基因的亞基因組，能夠大量表達替換結構基因的外源蛋白的大量表達。但是結構基因的缺失，其無法單獨包裝成具有感染力的病毒顆粒，也就無法再次感染細胞。利用這一特點，可以使用復制缺陷甲病毒作為外源基因表達載體。常見的甲病毒有基孔肯雅病毒(chikungunya?virus,?CHIKV)、辛德比斯病毒(sindbis?virus，SIN)、Semliki?Forest病毒(semliki?Forest?virus,?SFV).?以及委內瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan?equine?enceplitis?virus，VEEV)等。

披膜病毒科中的甲病毒表達載體系統是一種成熟、安全、高效的表達系統，已廣泛用于蛋白的表達、結構和功能的研究。由于該系統是一個高效的蛋白表達系統，因此也作為表達系統可以用來表達外源蛋白。其中最常用的該類病毒載體為辛德比斯病毒(sindbis?virus，SIN)、Semliki?Forest病毒(semliki?Forest?virus,?SFV).?以及委內瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan?equine?enceplitis?virus，VEEV)等多個病毒。

甲病毒表達載體系統的主要特點為由外源抗原基因取代結構蛋白基因，但保留了“自主復制”功能，能夠高水平的進行RNA復制和外源基因的表達。因此可以直接用做RNA、DNA疫苗。在甲病毒結構蛋白輔助載體幫助下，復制子DNA疫苗可以包裝成重組甲病毒顆粒，其可以成為一種重組的甲病毒病毒樣顆粒疫苗，它可通過和病毒感染一樣的途徑感染免疫細胞，從而有效地誘導機體免疫系統產生免疫保護反應。

甲病毒的核酸編碼序列可分為其結構蛋白序列和非結構蛋白序列。兩者的表達產物結合在一起才能包裝成具有感染力的病毒。甲病毒類的結構蛋白具有一定的毒性，野生型甲病毒類結構蛋白在細胞內的表達會引起細胞自殺。

現有的甲病毒表達載體系統，一般通過分析甲病毒的序列，然后將其結構蛋白序列和非結構蛋白序列分離，進而構建甲病毒表達載體系統。使用時，一般通過共轉染甲病毒復制子載體和結構蛋白輔助載體，得到子代病毒。

與常規DNA疫苗載體相比，甲病毒表達載體的基因組比較大，轉染效率較低，操作較為復雜。此外，該系統的子代病毒產量不能自主復制，因此不能大量產生重組的甲病毒。

由于甲病毒類的結構蛋白具有一定的毒性，會引起載體細胞自殺，含有現階段沒有合適的用來合成甲病毒類結構蛋白的穩定互補細胞系，以輔助完成病毒的包裝，也就無法得到可以穩定生產甲病毒載體系統的細胞系。所以該病毒系統用做大規模疫苗生產、蛋白表達等工業化操作，存在較大的障礙。另外同時轉染甲病毒載體和結構蛋白輔助載體容易產生重組的病毒克隆，產生回復突變，而形成感染性的病毒，因此存在一定的風險，一定程度上也限制了其應用。因此，現在使用的甲病毒表達載體系統中，使用的都是減弱突變型的甲病毒，并采用特殊的細胞系，以穩定生產甲病毒載體系統。

此外，由于甲病毒復制子系統，是通過大量擴增亞基因組到達大量擴增目的基因的目的。而甲病毒復制子系統是一種正調控系統，往往會引起目的基因的過量表達，而過量表達目的基因會影響病毒結構基因的表達，從而影響重組的甲病毒的產生，導致包裝出的甲病毒量較低。這在一定程度上影響了該系統的應用。

因此，現階段缺乏操作簡便，安全可靠的甲病毒表達載體系統。同樣也缺乏相應的疫苗制備方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種操作簡便，安全可靠的甲病毒表達載體系統。

本發明所采取的技術方案是：

復制缺陷型甲病毒表達載體系統，包括甲病毒復制子系統和甲病毒輔助包裝系統，甲病毒復制子系統的復制子含有至少一個啟動子和去除了編碼結構蛋白序列的甲病毒核酸序列，甲病毒輔助包裝系統的結構蛋白輔助子含有編碼甲病毒結構蛋白序列的反義核酸序列，反義核酸序列的5’端連接有基因復制調控開關核酸序列，基因復制調控開關核酸序列的5’端連接有基因復制啟動子。

結構蛋白復輔助子的甲病毒結構蛋白序列的反義核酸序列和基因復制調控開關核酸序列之間設有亞基因組增強子。