[發明專利]基于微流控芯片快速檢測分析阿米巴抗體的方法及其應用

無效

• 申請號: 201110041607.0
• 申請日: 2011-02-21
• 公開（公告）號: CN102645543A
• 公開（公告）日: 2012-08-22
• 發明（設計）人: 隋國棟;程訓佳;劉思秀;趙望;章黎;付永鋒
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: G01N35/00
• 分類號: G01N35/00;G01N33/96
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

技術領域

本發明涉及生物醫學領域，涉及一種基于微流控芯片快速檢測分析阿米巴抗體的方法及其應用，具體涉及一種基于微流控芯片專門用于高通量快速阿米巴病血清學診斷方法及其應用。

背景技術

溶組織內阿米巴(Entamoeba?histolytica，E.h)是引起阿米巴性結腸炎和腸外膿腫的病原體，具有侵入宿主組織或器官、適應宿主免疫反應和表達致病因子的能力。據統計，全世界約有五千多萬人感染溶組織內阿米巴，每年有10萬患者死于阿米巴病(amoebiasis)，為僅次于瘧疾的第二種致死性原蟲病。我國的平均感染率為0.949%，感染人數估計為1069萬（1992年數據）。

當前臨床診斷阿米巴感染的傳統方法是從糞便中檢出溶組織內阿米巴滋養體或包囊，但此方法的檢出率不高，實踐顯示，對于阿米巴肝膿腫病例也不易從膿液中檢出滋養體；而血清學檢驗對于診斷侵襲性阿米巴病具有其高敏感性和無創傷性的特點，且大多數無癥狀包囊攜帶者和阿米巴結腸炎患者血清中存在抗溶組織內阿米巴抗體，因此，血清學診斷是重要的阿米巴病實驗室診斷方法之一。目前血清學診斷主要采用酶聯免疫分析；酶聯免疫分析（ELISA）的原理是把抗原或抗體的固相化，同時也將抗原或抗體用酶標記，結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應；用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質分開，再加入酶標記的抗原或抗體，通過反應而結合在固相載體上，此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例，加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結果，使測定方法達到很高的敏感度；但是ELISA常規免疫分析通常需要數小時甚至一天以上，操作過程復雜，需消耗大量昂貴的免疫試劑，且檢測設備較大，并經常伴隨著非特異性吸附等諸多缺點，難以滿足現場檢驗要求。

20世紀90年代發展起來的微流體學科是指操作微小網絡通道（5-500微米）中流體的科學技術，是分子生物學技術、微加工技術、機械制造技術、計算機技術等多種現代技術的發展與融合，是基于大規模平行處理生物信息分子原理的微型裝置，具有信息通量大、自動化、系統化的特點；其中微流體芯片用于操作、傳輸微升（10^-6L）至毫微微升（10^-15L）量級的流體，可將生化反應的若干步驟包括分析、洗滌、檢測等集成在一塊或幾塊微流體芯片上，其微通道孔徑只有微米級大小，具有濃縮和富集的作用，可加速反應縮短測試時間，從而大大降低了測試成本。與常規的實驗技術相比，上述技術極大降低了試劑的消耗量（至少3個數量級）、同時分析產生的廢液極少；在微小范圍內的能量傳遞、物質分散更快更均勻，熱能傳導快，也更易實現各種操控，因此反應快、收率高，污染少、成本低。

目前，微流控芯片已從分離檢測發展為包括復雜試樣前處理的高功能全分析系統，從分析工具發展到包括在線檢測的微型化學反應與合成手段。在微流控芯片上進行免疫分析，將微流控芯片的分析能力和抗原-抗體反應的特異性相結合，能有效的克服常規免疫分析的缺點，使得反應效率提高，操作步驟簡化，檢驗時間縮短，樣品、試劑和能量消耗大大降低。微流控芯片多種功能結合與集成化的特點使微流控芯片上的免疫分析與常規免疫分析相比有很多潛在的優勢，因此受到越來越多的關注。但目前還未見有關基于微流控芯片快速檢測分析阿米巴抗體的方法的報道。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的缺陷和不足，提供一種基于微流控芯片快速檢測分析阿米巴抗體的方法及其應用，尤其涉及一種基于微流控芯片專門用于高通量快速阿米巴病血清學診斷方法及其應用。

具體而言，本發明以微流控芯片為基礎，建立一種基于微流控芯片快速檢測分析阿米巴抗體的方法，其包括如下步驟：

（1）將抗溶組織內阿米巴抗體泵入微流控芯片的分析室；

所述的微流控芯片的分析室為整體柱或聚合填料灌柱，其中，聚合填料為硅膠填料或其它有機聚合物，本發明優選有機聚合微球；

（2）泵入數個填料體積的溶組織內阿米巴蛋白溶液，通過特異性結合，使溶組織內阿米巴抗原與聚合微球填料結合；

（3）將含有5%牛白蛋白的磷酸鹽緩沖液泵入微流控芯片分析室，對結合重組溶組織內阿米巴抗原的聚合微球進行封閉；