[發明專利]一種疫苗黏膜免疫佐劑分子的制備方法

無效

• 申請號: 201110038963.7
• 申請日: 2011-02-16
• 公開（公告）號: CN102382853A
• 公開（公告）日: 2012-03-21
• 發明（設計）人: 馬興元;姚碧;鄭文云;劉琨
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C07K14/245;A61K39/39
• 代理公司: 上海翼勝專利商標事務所(普通合伙) 31218
• 代理人: 翟羽

技術領域

本發明涉及生物醫藥與疾病免疫領域，更具體地講，涉及應用于生化制藥等領域的經皮膚與粘膜免疫的疫苗佐劑，主要應用于人或動物的預防傳染病或腫瘤方面的疫苗，建立了一種類似于LT突變體及其亞基的多亞基復雜結構的蛋白制備方法。

背景技術

各種傳染病的不斷發生，對現有的疫苗提出了新的挑戰。比傳統更加簡便、快捷、更有利于大規模的接種的粘膜免疫疫苗，已成為目前國內研究的新方向。安全有效的粘膜免疫佐劑正成為粘膜免疫疫苗的關鍵。大腸桿菌熱敏感毒素（heat-labile?toxin,?LT）是目前世界上公認的免疫效果最好的之一。因此，采用基因工程技術高效制備減毒且可作為粘膜免疫佐劑的LT突變體（LTm）及其亞基已成為國內外研究普遍追求的目標。

但是，由于LT結構的特殊性與復雜性，主要表現在下列方面：LT基因可以編碼兩種蛋白亞基，電泳結果顯示一個分子量約為29KD、另一個約為12KD，LT在細胞中為穩定的二亞單位蛋白。LT分子量為87KD，國外科學家已經過一系列的交聯實驗及純化、電泳已確認，LT是由1個約29KD的A亞基（LTA）和5個約12KD的B亞基（LTB）組成的6聚體結構蛋白，國外的有的學者將其形象的比喻成“月球車”。

經研究表明，LT操縱子含有兩個基因，即編碼A亞基單位的toxA基因和編碼B亞單位的toxB基因，并轉錄成一條mRNA鏈，二者首尾相接4bp，LT-A的基因編碼區長765bp，編碼254個氨基酸，eltA上游約-76至-43bp處為啟動子序列，其中-76至-71bp區GCATAT和-49至-43bp區GTTATCT均為啟動子信號序列，核糖體結合位點TAAG位于起始密碼子ATG上游-13至-10bp區[43]。而eltB起始于eltA末端，LT-A的C末端的最后的兩個密碼子（TTATGA）與LT-B的N末端的兩個密碼子（ATGAAT）重疊，這表明eltA和eltB由同一啟動子操縱，eltA和eltB可能以共轉錄的方式合成mRNA。

B亞基雖然離啟動子比較遠，但是B亞單位比A亞單位表達量高很多，可能與其調控裝置有密切的關系，通常認為是由于toxB在mRNA上可能與核糖體的結合更加的牢固導致。在LT全蛋白中，A、B亞基比例是1：5，但是這并非是A亞基和B亞基在大腸桿菌真實表達量情況。在利用同位素示蹤法摻入對A、B單位的分泌及全毒素裝配動力學的研究發現，在細胞周質中的比例為1.4-1.7A/5B，其中絕大部分的B和A結合在一起，只有55%-60%的A和B結合，而多余的A亞基則被菌體自身降解。B亞單位被合成以后一分鐘內就被分泌到細胞的周質中，約80%會迅速的聚集成寡聚體。

X射線晶體結構分析表明，B亞基單位有兩組分別由三個反平行的β片層結構、一個N末端的α螺旋和一個長的位于中心的α螺旋組成，N末端的α螺旋通過二硫鍵與β5片層連接。B5聚體與A亞單位相鄰面平行，而中心的α螺旋從另一面向外延伸，形成一個由50-60為氨基酸組成的小環，按這種結構合成的肽段可誘導機體產生抗LT的抗體。B5聚體間只有相鄰的單體間有相互作用，5聚體形成后，原表面39%都會包埋起來，有利于維持B5聚體結構的穩定。其中心的α螺旋有25個陽離子和15個陰離子，可以形成一個強的親水區，雖然B5的離子中心里親水性很強，但是只有幾個特異性結合的相互作用力，即空洞中心兩頭的兩個疏水鍵和一個離子鍵。電鏡觀察顯示，圍繞這個中心的5個亞基結合成一個非常緊密的環狀結構。A亞基單位呈三角形結構，由兩個功能不同亞單位組成：有酶活性的A1亞單位和一個短的連接B5聚體的A1亞單位的A2β片層。A2亞單位由一個結構域，含有較短的9個α螺旋和9個β片層。A2亞單位起始于第200位氨基酸殘基，是A1的一個延伸α螺旋，在結構上它起始于三角形的一個角上。

因此，利用通常的基因工程技術制備實踐證明有較大的困難。在采用大腸桿菌作為表達宿主制備LT的過程中，LT在大腸桿菌中的表達量非常的低，只有1-5%。有研究表明，在LT基因正常表達形成LT蛋白的過程中，不到50%的LTA亞基與LTB亞基進行了結合裝配成AB5形式。通過調節LTA亞基和LTB亞基的表達量上的比例關系來達到提高LT的產量已成為熱點之一。

發明內容

本發明的目的在于提供一種疫苗黏膜免疫佐劑分子的制備方法，所述黏膜免疫佐劑為大腸桿菌熱敏感毒素LT、大腸桿菌熱敏感毒素突變體LTm以及大腸桿菌熱敏感毒素亞基蛋白LTA與LTB。