[發(fā)明專利]一種高分子冷凝聚法制備蘿卜幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110033110.4
• 申請日: 2011-01-30
• 公開（公告）號: CN102174483A
• 公開（公告）日: 2011-09-07
• 發(fā)明（設計）人: 蘇保榮;徐鳳彩;程京燕;胡永剛
• 申請（專利權(quán)）人: 珠海市御品堂生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/00
• 分類號: C12N9/00
• 代理公司: 廣東秉德律師事務所 44291
• 代理人: 楊煥軍;田學東

【技術領域】

本發(fā)明涉及一種高分子冷凝聚法制備蘿卜幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白的方法。

【背景技術】

蘿卜幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白(Raphanus?sativus?L?Chitin-binding?protin，縮寫R·CBP，蘿卜CBP)是一種能與幾丁質(zhì)特異結(jié)合的蛋白質(zhì)，業(yè)已證明它具有殺菌作用(華南農(nóng)業(yè)大學學報，1997，18(4)：72～75)：我們研究了該種蛋白質(zhì)的抑菌譜較廣，對白色葡萄球菌(Staphylococcus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus?aureus)、枯草桿菌(Bacillus?Subtilis(Ehrenberg)Cohn)等G⁺菌和變形桿菌(ProteusbacillusVulgaris)、大腸桿菌(Escherichia?Cdi)、鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonellatyphimwium)、多殺巴斯德氏桿菌(Pastewella?multaida)、雞白痢沙門氏菌(Salmnella)、產(chǎn)氣桿菌(Enterobacteratrogenes)等G^-菌以及酵母(SaccharomyceScerevisiae)，總狀毛霉(Mucor?racemosus)、里根霉、黑曲霉(Aspergillus?niger)、青霉等真菌都有消殺效果。同時，它還對白菜軟腐病菌(Frwinia?carovorasubsp)、柑橘潰瘍病菌(Citrus，Baterial?lanker?Disease)、番茄青枯病菌(RalstoniaSalanacearum)、稻瘟病菌(magnaporthe?grisea)、水稻紋枯病菌(RhizoctoniasolaniAG-11A)、玉米小斑病菌(Drechslera?maydis)、香蕉枯萎病菌(俗稱香蕉癌癥，F(xiàn)usarium?oxyporumsp.cubense)等植(作)物病原菌都有良好的殺菌作用。

這與目前市售溶菌酶完全不同，目前市售溶菌酶它們只對革蘭氏陰性(G^-)菌起作用，而對革蘭氏陽性(G⁺)菌、真菌都不起作用。

蘿卜CBP的分子組成、結(jié)構(gòu)和特性具有以下特點：

①是一種單成分單體酶，而且是一種誘導酶；

②是一種相對分子質(zhì)量較小(11.4KD左右)的堿性蛋白質(zhì)；

③是一種既具有溶酶活力，又具有幾丁質(zhì)酶的雙功能酶蛋白；

④其雙功能酶活力在0-60℃，pH2.4-10.0范圍內(nèi)活力穩(wěn)定，在室溫下兩年內(nèi)活力基本穩(wěn)定；

⑤在一定條件下，其酶蛋白結(jié)晶為長方形。活性中心包括有Glu、Asp、His和Trp殘基。這與動、微生物的酶不同，它多了一個His和Trp殘基；也與其它植物溶菌酶不同，它有一個Trp和His殘基，卻沒有Cys殘基，故抑菌效果不同；

⑥它還與其它溶菌酶和幾丁質(zhì)酶不同，它不是糖蛋白，不含任何鏈內(nèi)和鏈間二硫鍵，所以酶活性穩(wěn)定，抑菌效果明顯；

⑦其N-端氨基酸殘基順序為WDADMVAKUM，對此序列進行Blastp搜集，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中沒有任何與其相匹配的有關信息。肽質(zhì)量指紋圖譜分析鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在現(xiàn)有蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中也沒有任何與其相匹配的有關信息。從而證明它是一種新發(fā)現(xiàn)的既具溶菌酶又具幾丁質(zhì)酶活性的幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白。

依據(jù)其分子組成、性質(zhì)及其結(jié)構(gòu)特征，以及殺菌效果，尤其對G^-菌，特別是對真菌滅菌效果更為強烈，該蘿卜CBP具有廣泛的應用價值和良好的市場前景和潛力。在醫(yī)藥上，抗真菌藥極少，抗生素由于微生物的抗藥性和對機體的毒副作用，限制了其應用；在農(nóng)業(yè)上，農(nóng)作物病害90％以上是真菌引起的，由于農(nóng)藥的殘留和對環(huán)境的污染，也限制了應用，同樣在食品、日化、禽畜養(yǎng)殖的防病抗病等行業(yè)，蘿卜CBP用途極廣，有待開發(fā)利用。

蘿卜在我國各地均能種植，尤在嶺南等地一年四季均可抪種，蘿卜幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白的生產(chǎn)制備原料廣泛、價廉，但酶含量低，現(xiàn)有制備工藝較復雜，難以實現(xiàn)工業(yè)化。

聚丙烯膠(polycrylic?Acid，PAA)是以游離單體丙烯酸聚合而成的高分子化合物：

隨其聚合度不同相對分子質(zhì)量而異。PAA無毒、易溶于水，為多聚電介質(zhì)。在工業(yè)上常用作分散劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

本發(fā)明的目的是提供一種高分子冷凝聚法制備蘿卜幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白的方法，工藝較簡單，易于實現(xiàn)工業(yè)化，能較低成本且無環(huán)境污染。

上述目的通過以下技術方案實現(xiàn)：