[發明專利]一種高分子冷凝聚法制備蘿卜幾丁質結合蛋白的方法

有效

• 申請號: 201110033110.4
• 申請日: 2011-01-30
• 公開（公告）號: CN102174483A
• 公開（公告）日: 2011-09-07
• 發明（設計）人: 蘇保榮;徐鳳彩;程京燕;胡永剛
• 申請（專利權）人: 珠海市御品堂生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/00
• 分類號: C12N9/00
• 代理公司: 廣東秉德律師事務所 44291
• 代理人: 楊煥軍;田學東

1.一種高分子冷凝聚法制備蘿卜幾丁質結合蛋白的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)材料：取蘿卜洗凈，用刀將其表皮砍傷，在16-20℃下誘導4-7天，使其染菌，以誘導酶的合成，增加酶含量；

2)提取：用5-10mmol/L?NaHCO₃水溶液為提取液，取兩份等體積的提取液，每份提取液的體積與材料的質量比為1∶1；取一份提取液和材料勻漿，得第一勻漿液，離心，收集第一上清液；再將其殘渣和另一份提取液勻漿，得第二勻漿液，離心，收集第二上清液；合并第一上清液和第二上清液；

3)選擇性熱變性：將上述合并的上清液在反應罐內攪拌加熱至50-55℃，并維持4-6min，然后離心再收集得第三上清液；

4)超過濾濃縮：將第三上清液超過濾排除相對分子質量5000以下的可溶性物質，濃縮至原體積的1/3，得濃縮液；

5)冷凝反應：于上述濃縮液中，攪拌加入體積與上述濃縮液體積比為0.5％-0.8％的PAA，加畢轉至低溫5℃-10℃下，冷凝反應24小時至48小時，反應式PAA+R·CBP→PAA-R·CBP↓，得冷凝物，進行離心，得沉淀物PAA-R·CBP；

6)置換：于PAA-R·CBP中，在攪拌下加入含有80-120mmol/L?CaCl₂和5-10mmol/L?NaHCO₃的混合溶液，PAA-R·CBP的質量與混合溶液的體積的比為1∶16-17，反應式為PAA-R·CBP+Ca²⁺→PAA-Ca²⁺↓+R·CBP，進行離心，收集第四上清液，冷凍干燥得酶粉，沉淀物為PAA-Ca²⁺。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟5)中的PAA的加入量為：PAA體積與所述濃縮液體積比為0.5％。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟6)中的CaCl₂的質量濃度為100mmol/L。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟6)中混合溶液的加入量為：混合溶液的體積與PAA-R·CBP的質量的比值為16.78。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，還包括步驟7)：于PAA-Ca²⁺中加入80-120mmol/L?H₂SO₄溶液，反應式：PAA-Ca²⁺+SO4^2-→PAA+CaSO₄↓，離心出去沉淀，以回收PAA。