[發明專利]一種香蕉穿孔線蟲特異性LAMP檢測方法及其應用

有效

• 申請號: 201110032956.6
• 申請日: 2011-01-31
• 公開（公告）號: CN102154476A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發明（設計）人: 彭德良;彭煥;王瓊
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京兆君聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 11333
• 代理人: 初向慶

技術領域

本發明涉及植物病害的分子生物學檢測技術，特別涉及一種香蕉穿孔線蟲特異性LAMP檢測引物及LAMP快速分子檢測方法

背景技術

香蕉穿孔線蟲(Radopholus?similis)，，又名相似穿孔線蟲，它是一種具有毀滅性的外來入侵植物檢疫性有害線蟲，是我國對外植物檢疫對象之一。香蕉穿孔線蟲(Radopholus?similis)寄主范圍也非常廣泛，目前已報道的寄主多達360多種，主要分布在在熱帶及亞熱帶地區。

近年來，隨著國際貿易和出國旅游日趨頻繁，從香蕉穿孔線蟲疫區國家或地區引進各種花卉苗木及種質材料的種類和數量迅速增加，因此由寄主植物攜帶而將該線蟲傳入中國的可能性和傳入風險日益劇增。近年來在我國各口岸多批次截獲香蕉穿孔線蟲。由于該線蟲的寄主植物在中國廣泛分布，一旦入侵后將給我國農業生產帶來毀滅性的打擊和造成嚴重的損失。一旦香蕉穿孔線蟲擴散到田野，則極易定殖和流行。這將給中國的農業生產造成嚴重危害。

在香蕉穿孔線蟲的鑒定與檢測方面，往往以形態鑒定為主，但因為形態特征細微復雜，變化幅度較大及表型特征不穩定問題，傳統形態鑒定往往比較困難，導致誤診，傳統形態鑒定過程耗時、費力，需要專業人士操作，且需要大量線蟲樣本，在單頭線蟲水平上不能達到要求。在PCR技術上建立起來的分子鑒定方法，一定程度上克服了傳統形態鑒定上的缺陷。目前已有一些利用分子和生化方法鑒定香蕉穿孔線蟲的方法，如RFLP、一步雙重PCR和熒光定量PCR。在植物檢疫領域中，DNA分子標記是目前線蟲學研究中發展較快的一種鑒定手段。線蟲種特異性引物PCR擴增檢測或雙重PCR擴增檢測是近年重要植物線蟲分子診斷的重要進展之一。通過一次PCR測驗就可以在混合樣品中特異性地檢測出一個或多個線蟲種。如Mulholland?et?al.(1996)分別構建了馬鈴薯金線蟲和馬鈴薯白線蟲的特異性引物，描述了一種基于rDNA-ITS區域特異性等位多重PCR技術檢測這兩種線蟲的方法，能快速鑒定馬鈴薯白線蟲和馬鈴薯金線蟲及其復合種群。與標準的PCR途徑不同，這一技術在每個PCR反應中應用了3個引物，通用引物5.8SrRNA、馬鈴薯金線蟲的特異性引物ITS1-Gr和馬鈴薯白線蟲的特異性引物ITS1-Gp。Bulman?&?Marshall(1997)成功應用多重PCR技術快速診斷馬鈴薯孢囊線蟲。在研究了秘魯和澳大利亞的馬鈴薯金線蟲和馬鈴薯白線蟲的rDNA-ITS的序列結構基礎上，構建了馬鈴薯金線蟲的特異性引物PITSr3和白線蟲的特異性引物PITSp4，通用引物ITS5與PITSr3可以擴增343bp馬鈴薯金線蟲的特異性片段，與PITSp4可以擴增出265bp特異性識別馬鈴薯白線蟲的DNA片段。在一個PCR反應中，使用PITSr3，PITSp4和ITS5這3個引物，即使復合種群中金線蟲DNA的含量僅為白線蟲的百分之一，也能從復合種群檢測出金線蟲。

歐師琪、彭德良(Ou?SQ，Peng?DL，2008)設計構建了大豆孢囊線蟲特異性SCAR標記引物SCNFI和SCNRI，發明了大豆孢囊線蟲的一步雙重PCR檢測方法，檢測的特異性片段長度為494bp，建立快速準確檢測和早期診斷大豆孢囊線蟲的分子生物學方法和技術規程，可以檢測大豆孢囊線蟲單個孢囊、單頭二齡幼蟲和雄蟲，該項檢測技術獲得國家發明專利(ZL200510012246.1).

宛飛、彭德良等(2008)根據馬鈴薯腐爛莖線蟲rDNA-ITS區的序列特征，對我國甘薯莖線蟲兩個不同型群體各設計了一對特異性引物。A型甘薯莖線蟲特異引物為DDS1/DDS2，特異擴增片段為252bp；B型甘薯莖線蟲特異引物為DDL1/DDL2，特異擴增片段為485bp；引入線蟲通用引物D3A/D3B作內標，研究出一步雙重PCR特異性檢測甘薯莖線蟲不同類型群體的分子技術和方法，該分子檢測技術具有特異性強、方法可靠、靈敏性高、操作簡便，檢測的精確度達到單條線蟲的水平。