[發(fā)明專利]一種香蕉穿孔線蟲特異性LAMP檢測方法及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110032956.6
• 申請日: 2011-01-31
• 公開（公告）號: CN102154476A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發(fā)明（設計）人: 彭德良;彭煥;王瓊
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京兆君聯(lián)合知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(普通合伙) 11333
• 代理人: 初向慶

1.一種香蕉穿孔線蟲特異性LAMP檢測方法，其特征在于：其中的LAMP反應體系中所使用的引物分別是：

RSF3：5’-AGCTGGCGTATCTAGCCTG-3’，

RSB3：5’-AACGCCAGAACGCACAAC-3’，

RSFIP：5’-GCACCCAACGGACAAAACAACA-CATTCAGCCTCTGGGCATC-3’，

RSBIP：5’-GCAGCGCTGTGAGCCTGTTT-GTTCGCCCATTCTGGGTAC-3’，

RSLF：5’-AGGCGTCGTCCCAAGGTCA-3’。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，所述LAMP反應體系包括：引物混合液、反應混合液和1μL?DNA模板，用滅菌雙蒸餾水補全到25μL，所述引物混合液為外側(cè)引物RSF3和RSB3各0.2μM，內(nèi)側(cè)引物RSFIP和RSBIP各1.6μM，環(huán)引物RSLF為0.4μM；所述反應混合液為20mM?Tris-HCl，10mM(NH₄)₂SO₄，10mM?KCl，8mM?MgSO₄，0.1％Triton?X-100，0.8MBetaine，1.4mM?dNTPs，8U?Bst?DNA聚合酶大片段。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測方法，所述LAMP反應的條件為在61-65℃溫育30-90min，82℃保溫5-10min。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，所述LAMP反應的最終擴增產(chǎn)物中加入有顯色劑，所述顯色劑為SYBR?green?I與PCR級DMSO混合液，其體積比為1∶9。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，所述DNA模板為從罹病香蕉穿孔線蟲病的植物組織中提取。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測方法，所述提取的方法為：截取0.2-0.5cm長的罹病植物組織放入裝有48μL的LA緩沖液的離心管中，加入2μL的LB提取液，混合均勻后離心，放入液氮中速凍，用研磨棒將其搗碎，點動離心后將離心管放入65℃條件下溫育45min，95℃下反應10min，冷卻至室溫，點動離心后的上清液即可作為線蟲DNA模板，所述LA提取液為100mM?NaCl，pH?8.5的100mM?Tris-HCl，pH?7.4的50mM?EDTA，1％SDS和1％巰基乙醇組成，LB提取液為20mg/mL蛋白酶K。

7.一種香蕉穿孔線蟲特異性LAMP檢測試劑盒，包括：

1)引物混合液：外側(cè)引物RSF3和RSB3各0.2μM，內(nèi)側(cè)引物RSFIP和RSBIP各1.6μM，環(huán)引物RSLF為0.4μM，

2)反應混合液：20mM?Tris-HCl，10mM(NH₄)₂SO₄，10mM?KCl，8mM?MgSO₄，0.1％Triton?X-100，0.8M?Betaine，1.4mM?dNTPs，8U?Bst?DNA聚合酶大片段。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，還包括顯色劑，所述顯色劑為SYBR?green?I與PCR級DMSO混合液，體積比為1∶9。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，還包括從罹病植物組織中香蕉穿孔線蟲DNA提取試劑，由LA提取液和LB提取液組成，所述LA提取液由100mM?NaCl，pH?8.5的100mMTris-HCl，pH?7.4的50mM?EDTA，1％SDS和單獨分裝的占總體積比為1％巰基乙醇組成，LB提取液為20mg/mL蛋白酶K。

10.權(quán)利要求1-6任一香蕉穿孔線蟲特異性LAMP分子檢測方法或權(quán)利要求7-9任一試劑盒在診斷植物、土壤中的香蕉穿孔線蟲感染情況或鑒別香蕉穿孔線蟲中的應用。