[發明專利]一種檢測多種常見氨基酸的液相色譜方法

有效

• 申請號: 201110032844.0
• 申請日: 2011-01-30
• 公開（公告）號: CN102621250A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發明（設計）人: 段更利;周威
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

技術領域

????本發明屬于分析化學領域，涉及常見氨基酸的液相色譜檢測方法，具體涉及一種檢測多種常見氨基酸的液相色譜方法及用途。

背景技術

已知氨基酸(Amino?acid)為含有氨基和羧基的一類有機化合物的通稱，其示生物功能大分子蛋白質的基本組成單位，是構成動物營養所需蛋白質的基本物質。現有技術公開了氨基連在α-碳上的為α-氨基酸；天然氨基酸均為α-氨基酸。其中，常見的20種L-α-氨基酸包括：(1)精氨酸，(2)天冬酰胺，(3)谷氨酰胺，(4)絲氨酸，(5)天冬氨酸，(6)谷氨酸，(7)蘇氨酸，(8)甘氨酸，(9)丙氨酸，(10)脯氨酸，(11)甲硫氨酸，(12)纈氨酸，(13)苯丙氨酸，(14)色氨酸，(15)異亮氨酸，(16)亮氨酸，(17)組氨酸，(18)半胱氨酸，(19)賴氨酸，(20)酪氨酸，它們的結構通式為：

其中，賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸是人體不能合成的，必需由食物蛋白供給，該些氨基酸稱為必需氨基酸；所述的賴氨酸能促進大腦發育，是肝及膽的組成成分，能促進脂肪代謝，調節松果腺、乳腺、黃體及卵巢，防止細胞退化；所述的色氨酸能促進胃液及胰液的產生；所述的苯丙氨酸能參與消除腎及膀胱功能的損耗；所述的甲硫氨酸（又叫蛋氨酸）能參與組成血紅蛋白、組織與血清，有促進脾臟、胰臟及淋巴的功能；所述的蘇氨酸有轉變某些氨基酸達到平衡的功能；所述的異亮氨酸和亮氨酸能參與胸腺、脾臟及腦下腺的調節以及代謝；所述的纈氨酸作用于黃體、乳腺及卵巢。研究證實，人體雖能夠合成精氨酸和組氨酸，但合成的量通常不能滿足正常的需要，因此，這兩種氨基酸又被稱為半必需氨基酸，其中精氨酸是一氧化氮、尿素、鳥氨酸及肌丁胺的直接前體，是合成肌肉素的重要原素，且被用作聚胺、瓜氨酸及谷氨酰胺的合成；所述的精氨酸可協助舒張血管，是鳥氨酸循環中的一個組成成分具有極其重要的生理功能，有助于將血液中的氨轉變為尿素而排出，對抗高氨血癥,肝臟機能障礙等；精氨酸也是精子蛋白的主要成分,有促進精子的質量,提高精子運動能量的作用。所述的組氨酸對于嬰幼兒及動物的成長尤其重要，可用于治療心臟病，貧血，風濕性關節炎等疾病。

已報道的氨基酸的測定方法有如下若干種，但分別仍存在有下述若干不足或缺陷：⑴分光光度法，操作繁瑣且專屬性差；⑵2,?4-二硝基氯苯衍生化液相色譜法以及2,?4-二硝基氟苯衍生化液相色譜法，其衍生條件復雜苛刻，產物不穩定；⑶丹磺酰氯衍生化液相色譜法，其衍生條件難以控制，對溶液環境pH值敏感，衍生產物不穩定，專屬性差；⑷鄰苯二甲醛(OPA)衍生化液相色譜法，只能檢測伯胺基氨基酸，不能檢測脯氨酸類仲胺基氨基酸，且產物極不穩定；⑸9-氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)?衍生化液相色譜法，雖有文獻報道，但其色譜圖譜重現性差或者色譜條件極其復雜，實用性差，且缺乏對上述的20種氨基酸的系統性定量研究，該方法尚未推廣應用；⑹鄰苯二甲醛/9-氯甲酸芴甲酯(OPA?/FMOC-Cl)衍生化液相色譜法，其色譜條件相當復雜，對液相設備性能要求較高，一般研究機構無法開展研究；⑺異硫氫酸苯酯(PITC)衍生化液相色譜法，專屬性差，需要排除水的干擾，不適用于水溶性樣品的檢測。

發明內容

????本發明的目的是克服現有技術的缺陷和不足，提供一種檢測多種常見氨基酸的液相色譜方法。尤其涉及一種檢測20種常見氨基酸的液相色譜方法，本發明的液相色譜方法能簡便、準確的測定樣品中20種氨基酸含量。

具體而言，本發明的檢測多種常見氨基酸的液相色譜方法是快速測定氨基酸含量的柱前衍生的液相色譜方法，其特征在于，其包括步驟：將待測樣品經過樣品預處理后，加入反應溶劑及衍生化試劑進行衍生化反應，然后采用高效液相色譜法測定20種常見氨基酸衍生物的濃度，確定氨基酸的含量；

????本發明中，所述的樣品預處理是，取適量待測中性水溶液樣品，加入乙腈稀釋/沉淀蛋白。

本發明中，所述的樣品選自植物天然提取物、藥品、保健食品或飼料；或血漿、尿液、腦脊液、生物組織等生物材料。

本發明中，通過下述步驟測定動植物天然提取物氨基酸衍生物的濃度：定量分取動植物天然提取物樣品進行預處理(水溶液，已過微孔濾頭)，加入定量的反應試劑混勻，再加入硼酸鹽緩沖液及過量的衍生化試劑進行反應，渦旋混勻，放置一段時間后，用液相色譜法測定氨基酸衍生物的濃度；

所述的反應試劑為不含有活潑胺基的有機溶劑，選自乙腈、甲醇、丙酮、四氫呋喃、甲苯、苯或乙醚；