[發(fā)明專利]圣路易斯腦炎病毒樣顆粒的制備方法及其應(yīng)用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110032709.6
• 申請(qǐng)日: 2011-01-30
• 公開（公告）號(hào): CN102181408A
• 公開（公告）日: 2011-09-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡孔新;郭雪;咸慶杰;楊鵬飛;平芮巾;張麗萍;馬雪征
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C12N7/04
• 分類號(hào): C12N7/04;C12N15/40;C12N15/63;G01N33/569;G01N21/64;A61K39/12;A61P31/14
• 代理公司: 北京中創(chuàng)陽(yáng)光知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11003
• 代理人: 尹振啟

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于病毒學(xué)、分子生物學(xué)和生物制品領(lǐng)域，尤其是一種圣路易斯腦炎病毒樣顆粒的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

圣路易斯腦炎病毒屬于黃病毒科，黃病毒屬，1933年在美國(guó)圣路易、堪薩斯和密蘇里等地約發(fā)生3000多例圣路易斯腦炎病毒感染，于死亡病人腦中分離到此病毒而得名。圣路易斯腦炎病毒是有包膜的線性單股正鏈RNA病毒，基因組RNA約為11kb，病毒顆粒為圓形，大小約40～60?nm。通常，圣路易斯腦炎病毒的結(jié)構(gòu)蛋白中，C蛋白構(gòu)成病毒核衣殼，M蛋白、E蛋白為病毒的包膜蛋白。PrM蛋白是膜蛋白M的前體，除具有抗原功能區(qū)外，還有助于E蛋白的正確折疊及穩(wěn)定。E蛋白位于病毒顆粒的脂質(zhì)雙層中，構(gòu)成病毒顆粒表面的突起，含有多種B細(xì)胞和T細(xì)胞抗原表位，是圣路易斯腦炎病毒的主要保護(hù)性抗原。因此，prM蛋白和E蛋白成為研究圣路易斯腦炎的重要靶標(biāo)。

圣路易斯腦炎作為嚴(yán)重?fù)p害人類健康的病原微生物，具有高度傳染性，一經(jīng)流行將引發(fā)巨大社會(huì)恐慌，因此，研制快速高效的診斷試劑并找到一種有效的疫苗對(duì)于防止圣路易斯腦炎感染無疑具有重要意義。

盡管相關(guān)的研究工作在不少實(shí)驗(yàn)室開展，但由于圣路易斯腦炎病毒的高度傳染性，其病原體研究必須在P3級(jí)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，這也極大的限制了對(duì)圣路易斯腦炎病毒的進(jìn)一步了解。病毒樣顆粒由于類似真實(shí)的病毒顆粒結(jié)構(gòu)并不具有感染性使之成為用于圣路易斯腦炎病原體研究的安全的替代模型；其效果優(yōu)于基于單個(gè)病毒蛋白的免疫學(xué)檢測(cè)方法已得到證明，因此病毒樣顆粒的研制成功對(duì)于烈性病毒診斷試劑的研制具有顯著價(jià)值；同時(shí)，病毒樣顆粒代表一類特殊的亞單位疫苗，相比之下，它們更容易被機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別，并以一個(gè)更接近真實(shí)構(gòu)象的形式呈遞病毒抗原，因而是一個(gè)非常好的疫苗候選物。病毒樣顆粒是模擬真實(shí)病毒顆粒結(jié)構(gòu)的一種高效的亞單位疫苗，并且不含有感染性的病毒遺傳物質(zhì)；實(shí)際上，病毒樣顆粒完全沒有RNA或DNA病毒的基因組成分，只是具有滅活病毒或減毒活疫苗病毒顆粒衣殼的真實(shí)構(gòu)象，因而沒有病毒毒力回復(fù)或病毒基因重組或重配的可能。

因此，作為一種很有發(fā)展前景的疫苗候選物和安全的病毒研究替代模型，對(duì)于圣路易斯腦炎病毒這樣的病原體研究和預(yù)防控制無疑具有更為重要的意義。

開發(fā)一種方便、可靠的血清診斷方法來檢測(cè)受感染個(gè)體血清內(nèi)的抗圣路易斯腦炎病毒抗體不僅有利于臨床病毒病的診斷，而且對(duì)于感染流行病學(xué)都具有重要的意義。在血清學(xué)免疫檢測(cè)如EIA中使用細(xì)菌表達(dá)蛋白作為抗原存在較多潛在缺點(diǎn)。例如，在將大腸桿菌裂解液作為抗原用于免疫測(cè)試時(shí)會(huì)造成患者血清與大腸桿菌蛋白的非特異性交叉反應(yīng)性（Purdy等，1992，Archives?of?Virology,123:335-349）。另外，已經(jīng)證明，膜糖蛋白上的一些抗原和免疫原性表位與構(gòu)象高度相關(guān)，在大腸桿菌中表達(dá)的糖蛋白喪失了免疫原性和抗原性。

此外，信號(hào)肽在外源蛋白質(zhì)的表達(dá)中具有重要作用，不僅能引導(dǎo)外源蛋白質(zhì)的分泌表達(dá)，還與蛋白質(zhì)或其新生肽鏈在細(xì)胞內(nèi)的全方位的定位有關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容

為解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明一種圣路易斯腦炎病毒樣顆粒的制備方法，該方法具體為：

1）選取?GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中圣路易斯腦炎病毒Hubbard的基因序列、基因序列序列號(hào)為EU566860，進(jìn)行圣路易斯腦炎病毒基因的合成，獲得重組質(zhì)粒；

2）重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞293T，轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞收獲后進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)分析；

3）通過相應(yīng)的純化方法獲得相應(yīng)的表達(dá)蛋白，并形成圣路易斯腦炎病毒樣顆粒。

進(jìn)一步，所述步驟1）中PCR方法進(jìn)行圣路易斯腦炎病毒基因的合成，該P(yáng)CR方法具體為：

1)??????設(shè)計(jì)用于信號(hào)肽和SLEV-ME基因融合PCR的上下游引物，外源信號(hào)肽上游引物JF:5’CGggatccGCCACCATGGGAAAACGGTCAGCG?3’和下游引物JR:5’TGATAGGTTGACAACTGCAAGGCTCCTGCACAAGCTATGA?3’；ME上游引物?MEF：5’?TCATAGCTTGTGCAGGAGCCTTGCAGTTGTCAACCTATCA?3’和下游引物MER：5’?CCGctcgagCTATTAATGATGATGATGATGGTGGGC?3’；

2)??????以劃線部分分別為BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，以信號(hào)肽和SLEV-ME基因?yàn)槟０澹ㄟ^融合PCR擴(kuò)增JME基因全長(zhǎng)；