[發(fā)明專利]圣路易斯腦炎病毒樣顆粒的制備方法及其應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110032709.6
• 申請日: 2011-01-30
• 公開（公告）號: CN102181408A
• 公開（公告）日: 2011-09-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 胡孔新;郭雪;咸慶杰;楊鵬飛;平芮巾;張麗萍;馬雪征
• 申請（專利權(quán)）人: 中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院
• 主分類號: C12N7/04
• 分類號: C12N7/04;C12N15/40;C12N15/63;G01N33/569;G01N21/64;A61K39/12;A61P31/14
• 代理公司: 北京中創(chuàng)陽光知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11003
• 代理人: 尹振啟

1.一種圣路易斯腦炎病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，該方法具體為：

1）選取?GenBank數(shù)據(jù)庫中圣路易斯腦炎病毒Hubbard的基因序列、基因序列序列號為EU566860，進(jìn)行圣路易斯腦炎病毒基因的合成，獲得重組質(zhì)粒；

2）重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞293T，轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞收獲后進(jìn)行瞬時表達(dá)分析；

3）通過相應(yīng)的純化方法獲得相應(yīng)的表達(dá)蛋白，并形成圣路易斯腦炎病毒樣顆粒。

2.?如權(quán)利要求1所述的圣路易斯腦炎病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，所述步驟1）中PCR方法進(jìn)行圣路易斯腦炎病毒基因的合成，該P(yáng)CR方法具體為：

1）設(shè)計用于信號肽和SLEV-ME基因融合PCR的上下游引物，外源信號肽上游引物JF:5’CGggatccGCCACCATGGGAAAACGGTCAGCG?3’和下游引物JR:5’TGATAGGTTGACAACTGCAAGGCTCCTGCACAAGCTATGA?3’；ME上游引物?MEF：5’?TCATAGCTTGTGCAGGAGCCTTGCAGTTGTCAACCTATCA?3’和下游引物MER：5’?CCGctcgagCTATTAATGATGATGATGATGGTGGGC?3’；

2）以劃線部分分別為BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，以信號肽和SLEV-ME基因?yàn)槟０?，通過融合PCR擴(kuò)增JME基因全長；

3）凝膠回收試劑盒膠回收SLEV-JME片段，分別對SJME和pcDNA5/FRT進(jìn)行BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切，膠回收后T4?DNA連接酶連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α，挑取單克隆菌落，擴(kuò)菌提取重組質(zhì)粒。

3.?如權(quán)利要求1所述的圣路易斯腦炎病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，所述步驟2）中重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞293T的具體步驟為：轉(zhuǎn)染前18-24小時接種細(xì)胞到T25細(xì)胞瓶中；將10ug質(zhì)粒加入1ml無血清培養(yǎng)基中，再加入20ulPEI，室溫孵育10min;倒掉舊的培養(yǎng)基，用無血清培養(yǎng)基洗兩遍；加2ml培養(yǎng)基，37℃/5%CO2孵育3小時后補(bǔ)加2ml培養(yǎng)基，72小時后進(jìn)行瞬時表達(dá)分析。

4.?如權(quán)利要求1所述的圣路易斯腦炎病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，所述步驟3）中純化方法具體為：

1）?將所述轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞收獲物經(jīng)反復(fù)凍融及超聲破碎；

2）?將上清和破碎細(xì)胞離心去除細(xì)胞碎片；

3）?將澄清上清通過0.45um的過濾器過濾；

4）?收集上清，100KD超濾濃縮后加PBS離心緩沖液重復(fù)超濾濃縮；

5）?棄去上清，?PBS重懸；

6）?用10%-60%的連續(xù)性蔗糖梯度離心；

7）?離心分層后，逐層向下穿刺收集各個層面的所有樣品，分層收集各樣品包被ELISA通過E蛋白單克隆抗體或圣路易斯腦炎病毒多克隆血清確定重組蛋白位置，獲得圣路易斯腦炎病毒樣顆粒。

5.?一種以圣路易斯腦炎病毒樣顆粒的293T細(xì)胞為抗原建立的間接免疫熒光檢測方法，其特征在于，該方法具體為：收集轉(zhuǎn)染設(shè)定時間后的細(xì)胞，用預(yù)冷的1xPBS清洗細(xì)胞，取適量細(xì)胞滴到八孔顯微鏡載玻片上，晾干，用冷丙酮進(jìn)行固定，加入稀釋的抗SLEV抗體37度孵育設(shè)定時間，漂洗液洗滌;?加入異硫氰酸熒光素標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG?室溫結(jié)合；漂洗液洗滌后于熒光顯微鏡下觀察。

6.?一種以純化的圣路易斯腦炎病毒樣顆粒為抗原建立的蛋白印跡檢測方法，其特征在于，該方法具體為：

1）裂解的蛋白行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜；

2）?封閉：將膜放入可密封的塑料袋中，加入適量的TBS配置的脫脂奶封閉液中，室溫封閉設(shè)定時間；

3）抗體的結(jié)合：用TBS配置的脫脂奶稀釋純化的抗SLEV?鼠單克隆抗體作為一抗，將PVDF膜與稀釋好的抗體室溫?fù)u床孵育設(shè)定時間；

4）洗去未結(jié)合的抗體：用TBS-T漂洗濾膜；

5）二抗的結(jié)合：用TBS配置的脫脂奶稀釋HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體作為二抗，將洗滌后的PVDF膜與稀釋好的二抗室溫?fù)u床孵育設(shè)定時間后，將膜用TBS-T洗滌；

6）DAB顯色：用TBS洗滌膜，去除磷酸和Tween?20，將膜放入DAB底物顯色液中顯色，注意觀察顯色情況，至棕色條帶出現(xiàn)時終止反應(yīng)，照相后避光保存。