[發明專利]從細胞培養液或血漿組分中分離純化高純度活化凝血七因子的方法

無效

• 申請號: 201110031838.3
• 申請日: 2011-01-28
• 公開（公告）號: CN102161701A
• 公開（公告）日: 2011-08-24
• 發明（設計）人: 許必雄;郭頎然
• 申請（專利權）人: 上海興迪金生物技術有限公司
• 主分類號: C07K14/745
• 分類號: C07K14/745;C07K1/22;C07K1/14
• 代理公司: 上海光華專利事務所 31219
• 代理人: 許亦琳;余明偉

技術領域

本發明涉及生物醫藥技術領域，具體地說，是一種從細胞培養液或血漿組分中分離純化高純度活化凝血七因子的方法。

背景技術

凝血七因子(FVII)是一種依賴維生素K的糖蛋白，合成于肝臟，在血液中以很低的濃度存在(0.5mg/L)，并且主要以非活化的單鏈酶原形式存在，僅1％處于被活化狀態。七因子酶原可以被活化的凝血第十二因子、十因子、九因子、七因子或者凝血酶激活而形成活化七因子(FVIIa)。七因子是啟動外源凝血途徑所必須的酶原，它的激活是外源性凝血途徑的開始。活化七因子本身僅具有很低的蛋白酶解活性，而組織因子(TF)是活化七因子高度親和的受體，一旦活化七因子與組織因子相結合，則具有很高的活性。當創傷破壞了細胞屏障，在創傷或炎癥部位表達的組織因子進入血液循環，并與活化七因子相結合，進而凝血第十因子(FX)被激活為活化十因子(FXa)，導致少量凝血酶的產生，促使血小板在創傷部位凝集。活化七因子在血小板表面將凝血第十因子轉化為活化十因子，經過一系列復雜的步驟，活化十因子在損傷部位形成血凝塊。這種酶促反應局限在創傷部位，可能降低了全身凝血活化和血栓并發癥的危險。這一外源凝血途徑也成為解釋活化七因子能夠有特異性地快速發揮止血作用的原因。

臨床上活化七因子已經被廣泛應用于七因子缺乏癥的預防和由于七因子缺乏導致的出血病癥，以及存在有凝血因子八和九因子抗體(抑制物)的先天性血友病和繼發性血友病患者的自發性或手術性出血。目前市場上僅有丹麥諾和諾德公司(Novo?Nordisk)的諾琪(Novo?Seven)，主要用于治療先天性七因子缺乏癥導致的出血病癥，外科手術的出血，血友病等，2005年的銷售額達到了近10億美元，2006年上半年銷售又增長19％。諾琪是利用基因重組技術在哺乳動物細胞中表達活化形式的凝血七因子。而且諾和諾德公司公司還在積極地不斷拓展諾琪的臨床適應癥，國內外很多醫院和臨床醫生已經將其廣泛地應用在很多手術中，比如肝臟手術，腎移植，前列腺手術等。諾和諾德公司已經包括急性創傷性出血，燒傷性出血出血性休克，腦內出血和手術后出血進行了臨床試驗，因此活化七因子的市場前景非常廣闊。

七因子可以用基因工程的方法用工程細胞表達，如CHO或BHK細胞等。這些工程細胞將七因子以單鏈酶原的形式分泌到細胞培養液中，需要進行進一步的分離純化步驟已取得活化七因子純品。

在用低溫乙醇法生產血制品的過程中，非活化的七因子被富積在組分III中，由于工藝原因，不能將其單獨分離純化，最終加工成凝血酶原復合物(Prothrombin?complex?concentrate，PCC)，其中主要含有凝血因子II，VII，IX和X，它們都屬于依賴維生素K的凝血因子。凝血酶原復合物目前被廣泛應用于凝血因子II，VII，IX和X的缺乏癥，肝病出血，維生素K缺乏癥，外科手術異常出血，凝血因子八抑制物血友病和彌散性血管內凝血(DIC)。但由于PCC是幾種凝血因子的混合物，在臨床應用中很容易產生不良反應，如血栓栓塞等。因此，進一步分離純化得到高純度的凝血七因子，提高用藥效率和安全性有著很重要的意義。與基因重組的七因子相比，從血漿中分離純化七因子在成本上會具有較大優勢。因此，開發新工藝，從血漿組分中分離七因子并制成活化的活化七因子制劑，將有廣泛的市場前景，同時有利于提高血漿資源的綜合利用率，減少血漿資源浪費。

發明內容

本發明的目的是提供一種從細胞培養液或血漿組分中分離純化活化凝血七因子(FVIIa)的方法。

本發明的方法包含以下步驟：

A.原料親和層析純化：

原料過親和層析柱，并收集含有凝血七因子的洗脫液，所述親和層析柱中的親和層析介質上偶聯有凝血七因子單克隆抗體，所述原料為：表達重組凝血七因子的細胞培養液或者將血漿以低溫乙醇法沉淀得到的富含七因子的組分。

B.活化：

將經步驟A親和層析純化獲得的含有凝血七因子的洗脫液在4℃-15℃溫度條件下加入凝血酶及鎂離子，共同孵化18-24小時實現凝血七因子的活化。所述凝血酶的濃度為1-100IU/ml洗脫液，所述鎂離子的濃度為1-50mmol/l洗脫液。鎂離子來源于含鎂化合物，含鎂化合物優選MgCl₂。最優選的，所述凝血酶的濃度為15IU/ml，MgCl₂的濃度為10mmol/l。