[發(fā)明專利]從細胞培養(yǎng)液或血漿組分中分離純化高純度活化凝血七因子的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110031838.3
• 申請日: 2011-01-28
• 公開（公告）號: CN102161701A
• 公開（公告）日: 2011-08-24
• 發(fā)明（設計）人: 許必雄;郭頎然
• 申請（專利權）人: 上海興迪金生物技術有限公司
• 主分類號: C07K14/745
• 分類號: C07K14/745;C07K1/22;C07K1/14
• 代理公司: 上海光華專利事務所 31219
• 代理人: 許亦琳;余明偉

1.一種從細胞培養(yǎng)液或血漿組分中分離純化活化凝血七因子的方法，包含以下步驟：

A.原料親和層析純化：

原料過親和層析柱，并收集含有凝血七因子的洗脫液，所述親和層析柱中的親和層析介質(zhì)上偶聯(lián)有凝血七因子單克隆抗體，所述原料為：表達重組凝血七因子的細胞培養(yǎng)液或者將血漿以低溫乙醇法沉淀得到的富含七因子的組分；

B.活化：

將經(jīng)步驟A親和層析純化獲得的含有凝血七因子的洗脫液在4℃-15℃溫度條件下加入凝血酶及鎂離子，共同孵化18-24小時實現(xiàn)凝血七因子的活化；

C.將步驟B的活化產(chǎn)物濃縮并進行病毒滅活獲得最終產(chǎn)物。

2.如權利要求1所述從細胞培養(yǎng)液或血漿組分中分離純化活化凝血七因子的方法，其特征在于，步驟B中，所述凝血酶的濃度為1-100IU/ml，所述鎂離子的濃度為1-50mmol/l。

3.如權利要求2所述從細胞培養(yǎng)液或血漿組分中分離純化活化凝血七因子的方法，其特征在于，步驟B中，所述凝血酶的濃度為15IU/ml，Mg離子的濃度為10mmol/l。

4.如權利要求1或3所述從細胞培養(yǎng)液或血漿組分中分離純化活化凝血七因子的方法，其特征在于，步驟B中，所述鎂離子來源于MgCl₂。

5.如權利要求1所述從細胞培養(yǎng)液或血漿組分中分離純化活化凝血七因子的方法，其特征在于，步驟A中，所述親和層析柱中的親和層析介質(zhì)為多糖類高分子親水性物質(zhì)，或者為采用多孔剛性支撐且表面覆蓋有多糖類高分子親水性物質(zhì)的介質(zhì)。

6.如權利要求5所述從細胞培養(yǎng)液或血漿組分中分離純化活化凝血七因子的方法，其特征在于，所述多糖類高分子親水性物質(zhì)為葡聚糖或瓊脂糖。

7.如權利要求1所述從細胞培養(yǎng)液或血漿組分中分離純化活化凝血七因子的方法，其特征在于，步驟A中，所述親和層析介質(zhì)在與凝血七因子單克隆抗體偶聯(lián)前，其羥基經(jīng)化學修飾引入了高反應活性的小分子化學基團。

8.如權利要求7所述從細胞培養(yǎng)液或血漿組分中分離純化活化凝血七因子的方法，其特征在于，所述的高反應活性的小分子化學基團為溴化氰、環(huán)氧基團或巰基。

9.如權利要求1所述從細胞培養(yǎng)液或血漿組分中分離純化活化凝血七因子的方法，其特征在于，將血漿以低溫乙醇法沉淀得到的富含七因子的組分為組分II+III或者為組分III。

10.如權利要求1所述從細胞培養(yǎng)液或血漿組分中分離純化活化凝血七因子的方法，其特征在于，步驟A中，所述凝血七因子單克隆抗體與凝血七因子的親和系數(shù)Ka為1.65×10⁸L/mol，在洗脫液存在下的解離系數(shù)Kd為6.06×10^-9M。

11.如權利要求1所述從細胞培養(yǎng)液或血漿組分中分離純化活化凝血七因子的方法，其特征在于，步驟A中，所述凝血七因子單克隆抗體包括重鏈與輕鏈，其中重鏈氨基酸序列為：SEQ?ID?NO：1，輕鏈氨基酸序列為：SEQ?ID?NO：2。

12.如權利要求1所述從細胞培養(yǎng)液或血漿組分中分離純化活化凝血七因子的方法，其特征在于，步驟A具體包括下列步驟：

1)原料前處理：

表達重組凝血七因子的細胞培養(yǎng)液的處理：細胞培養(yǎng)液經(jīng)超濾濃縮后將pH調(diào)至7.0-8.0；

血漿以低溫乙醇法沉淀得到的富含七因子的組分的處理：組分用pH7.0-8.0的樣品緩沖液復溶，調(diào)節(jié)溶液pH為7.0-8.0；

2)上樣：親和層析柱平衡，而后將經(jīng)步驟1)處理后的原料上樣，上樣流速為每分鐘0.5-100毫升；

3)洗脫：用pH2.0-pH5.0的洗脫緩沖液洗脫，收集凝血七因子組分。

13.如權利要求12所述從細胞培養(yǎng)液或血漿組分中分離純化活化凝血七因子的方法，其特征在于，所述樣品緩沖液為pH7.4的磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉緩沖液或pH7.4三羥甲基氨基甲烷/鹽酸緩沖液；所述洗脫緩沖液為pH2.5的甘氨酸/鹽酸緩沖溶液或pH2.5的醋酸/醋酸鈉緩沖液。

14.如權利要求1所述從細胞培養(yǎng)液或血漿組分中分離純化活化凝血七因子的方法，其特征在于，步驟C中，病毒滅活為兩步病毒滅活，第一步為納米膜過濾，第二步病毒滅活為干熱法病毒滅活。