[發(fā)明專利]一種新的宮頸癌細(xì)胞株（N-Caski）及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110031528.1
• 申請(qǐng)日: 2011-01-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102154214A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-08-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 謝幸;周建松;呂衛(wèi)國(guó);葉楓;程曉東;王新宇;王小云;洪蝶;彭嬋娟
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 謝幸;浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10;C12N15/113;C12N15/867;C12Q1/02;C12R1/91
• 代理公司: 杭州豐禾專利事務(wù)所有限公司 33214
• 代理人: 王從友

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種新的宮頸癌細(xì)胞株（N-Caski）。該細(xì)胞株，通過(guò)慢病毒載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)HPV16型致癌基因E6/E7的穩(wěn)定干擾。

背景技術(shù)

宮頸癌是女性僅次于乳腺癌第二大常見(jiàn)的惡性腫瘤，全世界每年新發(fā)宮頸癌約46.6萬(wàn)，我國(guó)就有13萬(wàn)左右，占1/4強(qiáng)。近年來(lái)，宮頸癌發(fā)病呈現(xiàn)出不斷上升、發(fā)病過(guò)程縮短和年輕化趨勢(shì)。經(jīng)證實(shí)高危HPV感染是宮頸癌發(fā)病關(guān)鍵的和必要的致病因素，作為宮頸癌的致病因子，HPV的特點(diǎn)是：1）流行廣泛—感染率15%～40%，其中的15～20%HPV持續(xù)性感染；2）傳播途徑確定—性傳播；3）作用機(jī)制明確，而HPV?E6E7癌基因則是導(dǎo)致和維持宮頸癌惡性表型的關(guān)鍵基因。基于宮頸癌和HPV?的特點(diǎn)，若能對(duì)高危HPV持續(xù)陽(yáng)性患者進(jìn)行高危HPV癌基因的表達(dá)的阻斷，就能阻斷HPV的致癌作用，從而阻斷宮頸癌前病變和宮頸癌的發(fā)生。這對(duì)減少宮頸癌的發(fā)生具有現(xiàn)實(shí)的重要意義。正因如此，宮頸癌高危HPV阻斷治療方法的研究是當(dāng)今的熱點(diǎn)之一，而最具潛力的技術(shù)就是RNA干擾技術(shù)。而宮頸癌也有望成為基因阻斷技術(shù)(RNAi)治療癌癥的第一個(gè)理想模型。

HPV16?E6、E7?siRNA作用于人宮頸癌細(xì)胞株的實(shí)驗(yàn)研究(第五屆中國(guó)腫瘤學(xué)術(shù)大會(huì)暨第七屆海峽兩岸腫瘤學(xué)術(shù)會(huì)議、國(guó)際腫瘤細(xì)胞與基因治療學(xué)會(huì)會(huì)議、第二屆中日腫瘤介入治療學(xué)術(shù)會(huì)議論文集?,?2008?年)設(shè)計(jì)E6、E7?siRNA,經(jīng)脂質(zhì)體包裹后轉(zhuǎn)染兩株細(xì)胞,通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)染前后各時(shí)間段兩基因mRNA及蛋白的表達(dá)情況的檢測(cè),驗(yàn)證RNAi作用的特異性及時(shí)效性。為探討使用siRNA治療宮頸癌的可行性提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

兩株宮頸癌細(xì)胞株中HPV_(16)E_6/E_7蛋白的表達(dá)（現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),?Modern?Preventive?Medicine,?編輯部郵箱?2004年?04期?）探索及檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞株?Caski、?Si?Ha細(xì)胞內(nèi)?HPV1?6?(16型人乳頭瘤病毒?)?E6?/E7蛋白含量?,篩選宮頸癌基因治療研究的合適細(xì)胞株。

RNA干擾技術(shù)抑制HPV16?E6基因表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞株CaSki增殖的影響(四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),?Journal?of?Sichuan?University(Medical?Science?Edition),?編輯部郵箱?2008年?01期?)?觀察HPV16?E6小干擾RNA(siRNA)能否抑制宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng),并探討其作用機(jī)理。

但是，現(xiàn)有RNA干擾技術(shù)中SiRNA及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的短效性，在研究中需要多次轉(zhuǎn)染，這無(wú)疑會(huì)增加了人力投入及研究成本。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有RNA干擾技術(shù)中存在的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種新的宮頸癌細(xì)胞株，該宮頸癌細(xì)胞株可直接用于研究中各項(xiàng)相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)，省時(shí)省事。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述的宮頸癌細(xì)胞株的建立方法。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述的宮頸癌細(xì)胞株的應(yīng)用。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供用于構(gòu)建上述的宮頸癌細(xì)胞株SiRNA序列。

為了實(shí)現(xiàn)上述第一個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案：

一種新的宮頸癌細(xì)胞株，該宮頸癌細(xì)胞株（N-Caski）保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為：CCTCC?NO.?C2010128。

為了實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案：

一種如權(quán)利要求1所述的宮頸癌細(xì)胞株的建立方法，該方法包括以下步驟：

1）選取針對(duì)HPV16型E6/E7共同啟動(dòng)子區(qū)的干擾效果較好的SiRNA序列,并設(shè)計(jì)符合慢病毒載體要求的shRNA序列，shRNA序列的編碼鏈序列如SEQ?ID?NO:1所示，隨從鏈序列如SEQ?ID?NO:2所示；

2）構(gòu)建宮頸癌HPV16?E6/E7啟動(dòng)子基因shRNA重組慢病毒載體，篩選出高滴度慢病毒；

3）轉(zhuǎn)導(dǎo)Caski細(xì)胞，抗生素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞。

作為優(yōu)選，上述的載體選用pLenti6/BLOCK-iT-DEST載體。

為了實(shí)現(xiàn)上述第三個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案：

上述的宮頸癌細(xì)胞株（N-Caski）用于作為宮頸癌HPV16?E6/E7癌基因的致病機(jī)制的探討及相關(guān)信號(hào)通路的研究的細(xì)胞模型。

上述的宮頸癌細(xì)胞株（N-Caski）用于宮頸癌治療藥物的挑選及驗(yàn)證。

為了實(shí)現(xiàn)上述第四個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案：

shRNA序列，該shRNA序列的編碼鏈序列如SEQ?ID?NO:1所示，隨從鏈序列如SEQ?ID?NO:2所示。