[發明專利]一種仿刺參AjE101微衛星DNA標記的檢測方法

無效

• 申請號: 201110028334.6
• 申請日: 2011-01-26
• 公開（公告）號: CN102140522A
• 公開（公告）日: 2011-08-03
• 發明（設計）人: 王艷紅;胡超群;任春華;夏建軍
• 申請（專利權）人: 中國科學院南海海洋研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛

技術領域

本發明屬于分子生物學DNA標記技術與應用領域，具體涉及海洋經濟種仿刺參(Apostichopus?japonicus)?的EST?(Express?Sequence?Tag，表達序列標簽)?微衛星標記篩選開發和應用。

背景技術

仿刺參為刺參科仿刺參屬的動物，俗名刺參。分布于北太平洋區、包括俄羅斯、日本、朝鮮半島沿岸以及中國，常見于波流靜穩、海草繁茂和無淡水注入的港灣內底質為巖礁或硬底。仿刺參是食用海參中品質最好，分布最廣，產量最大的一種。在我國，仿刺參養殖業主要分布于遼寧、河北、山東、江蘇等地等沿海地區。目前,仿刺參的研究大多是關于仿刺參常規育種、增養殖等領域,關于分子標記方面的研究比較少。開發遺傳標記并用于遺傳圖譜構建、品種鑒定、遺傳多樣性等方面的研究無疑是解決仿刺參養殖過程中出現問題的一個有效途徑之一。

隨著仿刺參在分子生物學領域的研究工作不斷深入，對仿刺參分子標記的需求也越來越多。遺傳改良或品種培育是仿刺參養殖穩定發展的動力，許多研究表明，遺傳變異水平與生物的生長速度、抗病能力等生產性狀密切相關，因此，開發仿刺參的分子遺傳標記，檢測仿刺參遺傳多樣性、研究其遺傳結構，進而實施分子標記輔助選育，對于仿刺參的育種和增養殖都具有十分重要的意義。

EST是指通過從cDNA文庫中隨機挑取的克隆,?進行大規模測序所獲得的cDNA的5’或3’端序列，長度一般為150-500?bp。近年來大量快速增長的EST數據已成為SSR的重要來源，約有1％-?5％的EST含有SSR。與gSSR（基因組微衛星）標記相比，從EST序列中中獲得EST-SSR標記更經濟，更有特點；由于EST是功能基因的表達片段，在其中發現的微衛星標記會直接和功能基因相關，并有可能和一些生產性狀相關聯，這些特點對遺傳圖譜構建以及標記輔助選育都有很高的應用價值；同時，由于不同物種間基因共顯性和保守性，從一種物種中開發的EST-SSR可能同時用于近緣的其他物種研究，從而為比較基因組學、同源基因克隆提供新的途徑。因此，EST-SSR已被用于構建遺傳圖譜、分離與鑒定新基因、基因表達差異研究、比較基因組研究和制備DNA芯片等方面。利用EST微衛星標記，可能把仿刺參重要經濟性狀與之關聯起來，達到分子標記輔助育種的目的，并可進一步進行仿刺參功能基因的研究。目前關于仿刺參EST微衛星標記的研究還很少。

發明內容

本發明的目的是為了簡便快速的鑒定仿刺參AjE101遺傳標記基因座位的遺傳變異圖譜，豐富現有的仿刺參微衛星標記，尋找更多的多態性好、穩定性高的微衛星標記，提供了一種仿刺參AjE101微衛星DNA標記的檢測方法。

本發明是通過以下方案實現的：

一種仿刺參AjE101微衛星特異性DNA引物，其特征在于其核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO：1和?SEQ?ID?NO：2所示。

一種利用仿刺參AjE101微衛星特異性DNA引物的PCR反應體系，其特征在于所述的PCR體系為：10×PCR緩沖液：2.0μl；10mM的SEQ?ID?NO：1和?SEQ?ID?NO：2引物對各：0.2-0.5μl；10mM?dNTP：0.4-5μl；ddH₂O：14.6-15.9μl；5U/μl?Taq酶：0.2-0.3μl；10ng仿刺參DNA：1-1.5μl。

一種仿刺參AjE101微衛星DNA標記的檢測方法，其特征在于包括以下步驟：先提取仿刺參基因組并稀釋備用，再利用仿刺參AjE101微衛星DNA核心序列（AT）n?其中n=22-24，在其序列兩端設計特異性引物，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1-2所示；然后使用該引物對仿刺參不同群體或者群體內個體的基因組DNA進行PCR擴增，對PCR產物進行變性聚丙烯酰胺凝膠檢測。利用產物出現的條帶銀染顯色后進行分析，確定每個個體的基因型，從而獲得仿刺參在AjE101遺傳標記基因座位的多態性遺傳變異圖譜（如圖1所示）。

AjE101微衛星DNA序列的特異性引物核苷酸序列分別為：正鏈SEQ?ID?NO：1：5’-TAGCCGTTTCATCCTTCA-3’，負鏈SEQ?ID?NO：2：?5’-ATGACAAGAAACGGGAGA-3’，退火溫度為49-55℃。