[發明專利]一種仿刺參AjE101微衛星DNA標記的檢測方法

無效

• 申請號: 201110028334.6
• 申請日: 2011-01-26
• 公開（公告）號: CN102140522A
• 公開（公告）日: 2011-08-03
• 發明（設計）人: 王艷紅;胡超群;任春華;夏建軍
• 申請（專利權）人: 中國科學院南海海洋研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛

1.一種仿刺參AjE101微衛星特異性DNA引物，其特征在于其核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO：1和?SEQ?ID?NO：2所示。

2.一種利用如權利要求1所述DNA引物的PCR反應體系，其特征在于所述的PCR體系為：10×PCR緩沖液：2.0μl；10mM的SEQ?ID?NO：1和?SEQ?ID?NO：2引物對各：0.2-0.5μl；10mM?dNTP：0.4-5μl；ddH₂O：14.6-15.9μl；5U/μl?Taq酶：0.2-0.3μl；10ng仿刺參DNA：1-1.5μl。

3.一種仿刺參AjE101微衛星DNA標記的檢測方法，其特征在于包括以下步驟：先提取仿刺參基因組并稀釋備用，再利用仿刺參AjE101微衛星DNA核心序列（AT）n?其中n=22-24，在其序列兩端設計特異性引物，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1-2所示；然后使用該引物對仿刺參不同群體或者群體內個體的基因組DNA進行PCR擴增，對PCR產物進行變性聚丙烯酰胺凝膠檢測。

4.如權利要求3所述的檢測方法，其特征在于其PCR反應加樣參數為：正反向引物SEQ?ID?NO：1-2各為0.2?uM,?0.2?mM?dNTP,?1×PCR?緩沖液,?1.5-2.5?mM?Mg²⁺,?0.6?U?Taq酶，50-100?ng?DNA模板，用雙蒸水補足到20ul；使用該引物的時設置PCR程序參數為：94℃預變性2分鐘；然后94℃變性30-40秒，45℃-60℃退火30秒，72℃延伸30秒-1分鐘，重復此反應35個循環。

5.如權利要求3所述的檢測方法，其特征在于對PCR產物的檢測：基因組DNA模板進行PCR擴增，其產物在6%~8%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，干燥后在掃描保存圖片，分析多態性，得到各個個體的基因型，并進一步確定AjE101遺傳標記基因座位的多態性遺傳變異圖譜。

6.如權利要求5所述的檢測方法，其特征在于在PCR產物的檢測中利用長度差異為50?bp的DNA?梯型及PBR322?標記作為電泳的分子量標記；電泳的電壓為1－8V/cm。

7.如權利要求5所述的檢測方法，其特征在于PCR擴增產物用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳-銀染系統進行檢測：?PCR產物中加上變性緩沖液?之后95℃變性5分鐘，之后立刻置于冰上降溫，使用微量進樣器上樣5ul，85?W?恒功率電泳至溴酚蘭帶至膠板的底端，120?分鐘后，用終濃度0.5μg/ml的溴化乙錠染色30分鐘，然后在凝膠成像系統下觀察記錄成像結果。