[發明專利]一種快速提取血液總核糖核酸的方法

有效

• 申請號: 201110027557.0
• 申請日: 2011-01-25
• 公開（公告）號: CN102154264A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發明（設計）人: 韓典霖;俞萍;李曉晨;孫克非
• 申請（專利權）人: 天根生化科技（北京）有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 羅文群

技術領域

本發明涉及一種快速提取血液總核糖核酸的方法，屬于核酸純化領域。

背景技術

外周血在人和動物體內免疫反應及代謝中發揮著重要作用，作為一種特殊的組織由于其易獲得性，在基礎和臨床研究中具有很重要的地位。外周血可作為造血系統疾病研究中的分子標志以及用于體外診斷系統的開發，還可用于血液系統外眾多系統疾病的分子監測。其中，有效提取外周血核糖核酸(以下簡稱RNA)過程中最重要的一步。但由于血液本身的易凝固性，以及血液內多種細胞的復雜性，以及其不像實體組織那樣可以凍存后再提取RNA，使得血液高質量的RNA的提取非常艱難，尤其應用基因芯片對之進行全基因表達譜掃描時，對RNA的質量和數量要求就更為嚴格。

從血液中提取RNA面臨的最大難題之一是RNA非常不穩定：研究表明在采血后的短短幾個小時內RNA即迅速且顯著降解，另外部分RNA在采血后受到誘導，表達增加。這種RNA降解和基因的體外誘導表達會導致在分析體內基因轉錄本豐度時出錯，甚至低豐度的信息丟失。而傳統的離心柱法提取血液RNA需要先從全血中分離出白細胞，并且需要過濾步驟后才能開始和吸附柱結合。在與吸附柱結合前的步驟繁瑣，并且需要40分鐘以上。

發明內容

本發明的目的是提出一種快速提取血液總核糖核酸的方法，采用一種新的快速紅細胞裂解液使紅細胞膜裂解和血漿分散，并且通過十六烷基三甲基硫酸銨成分能立刻和RNA形成復合體沉淀，以保證核糖核酸的完整性，并使提取過程高效、快速。

本發明提出的快速提取血液總核糖核酸的方法，包括以下步驟：

(1)向100～400微升全血中加入快速紅細胞裂解液，加入的體積比為：全血∶紅細胞裂解液＝1∶5，顛倒混勻8～10次，得到混合物；

(2)對上述混合物進行離心分離，離心分離的轉速為7300轉/分鐘，離心分離時間為3分鐘，取出離心分離的沉淀物；

(3)在上述沉淀物中加入240微升懸浮液，研磨至沉淀完全溶解，加入200微升裂解液，混勻，再加入20微升蛋白酶K溶液，充分顛倒混勻，55℃下放置10分鐘，顛倒混勻，得到溶液；

(4)在上述溶液中加入240微升無水乙醇，混勻后轉入硅膜吸附柱中，進行吸附離心，離心吸附的轉速為12000轉/分鐘，離心吸附時間為1分鐘，倒去廢液；

(5)向步驟(4)的硅膜吸附柱中加入350微升去蛋白液，進行第一次去蛋白離心，去蛋白離心轉速為12000轉/分鐘，去蛋白離心時間為15秒，倒去廢液；

(6)向步驟(5)的硅膜吸附柱中加入活性單位為0.375Kunitz的脫氧核糖核酸酶溶液80微升，室溫下放置15分鐘后，再加入350微升去蛋白液，進行第二次去蛋白離心，去蛋白離心轉速為12000轉/分鐘，去蛋白離心時間為15秒，倒去廢液；

(7)向步驟(6)的硅膜吸附柱中加入500微升漂洗液，室溫下靜置2分鐘，進行脫鹽離心，脫鹽離心的轉速為12000轉/分鐘，脫鹽離心時間為15秒，倒去廢液；重復該步驟一次；

(8)對步驟(7)的硅膜吸附柱進行干燥離心，干燥離心的轉速為12000轉/分鐘，干燥離心時間為2分鐘，將吸附柱置于室溫下2～5分鐘，去除吸附材料中的漂洗液；

(9)在步驟(8)的硅膜吸附柱中加入30～50微升無核糖核酸酶的水，室溫下放置2分鐘后，進行洗脫離心，洗脫離心的轉速為12000轉/分鐘，洗脫離心時間為2分鐘，得到核糖核酸溶液。

上述方法中，所述的快速紅細胞裂解液的各組分的質量為：

氯化銨????????????????????60～100克

碳酸氫鉀??????????????????15～20克

乙二胺四乙酸四鈉??????????6～8克

十六烷基三甲基硫酸銨??????5～10克

將上述各組分稱重后混合，加去離子水，得到混合液，用氫氧化鈉溶液調混合液的pH值至7.2～7.4，并使混合液體積為1000毫升。

上述方法中，所述的懸浮液的配方為：

酒石酸鈉??????????????????11.5～17.25克

鹽酸胍????????????????????573～764克

乙基苯基聚乙二醇(NP40)????5～10毫升

將上述各組分量取后混合，加去離子水，并使混合液體積為1000毫升

本發明提出的快速提取血液總核糖核酸的方法，其優點是：